【国家标准(GB)】 SPF鸡 红细胞凝集抑制试验

GB/T 17999. -. 1999
本标准以我国建立的HI方法为基础，参照美国SPAFAS公司的有关操作规程，规定SPF鸡红细胞凝集抑制试验。
SPF鸡微生物学质量控制国家系列标准包括SPF鸡微生物学监测总则和9种SPF鸡微生物学检测方法。本标准为《SPF鸡红细胞凝集抑制试验》。SPF鸡微生物学检测方法还包括以下部分：GB/T17999.2--1999
SPF鸡
GB/T 17999. --.1999
GB/T 17999. --1999
GB/T 17999. 5---1999
GB/T17999.61999
GB/T 17999.7--1999
GB/T 17999.8 1999
GB/T 17999. 9-
--1999
SPF鸡
SPF鸡
SPF鸡
SPF鸡
SPF鸡
SPF鸡
SPF鸡
血清中和试验；
血清平板凝集试验；
琼脂扩散试验；
酶联免疫吸附试验；
胚敏感试验；
鸡白痢沙门氏菌检验；
试管凝集试验；bzxZ.net
间接免疫荧光试验
本标准由中华人民共和国农业部、国家科学技术部提出。本标准由农业部畜牧兽医司归口。本标准起草单位：农业部实验动物研究中心、山东省农科院家禽研究所。本标准主要起草人：陈德威、赵立红、靳彦华、张秀美、李军。66
1范围
中华人民共和国国家标准
SPF鸡
红细胞凝集抑制试验
SPF chicken Hemagglutination inhibition testGB/T 17999.1.- 1999
本标准规定了红细胞凝集抑制试验所用试剂、材料，操作程序及结果判定等。本标准适用于SPF鸡感染以下病原微生物后的血凝抑制抗体监测：禽流感病毒（A型)[AvianIn+luenza Virus（Type A）】.传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus），新城疫病毒（NewcastleDiseascVirus），禽腺病毒Ⅲ群（减蛋综合症）（AvianAdenovirusGroupⅢ），鸡毒支原体（MycoplasmaGallisepticum），滑液囊支原体（Mycoplasma Synoviae）。2原理
许多病毒具有凝集动物红细胞的能力，这种凝集红细胞的能力能被特异性抗体所抑制，因此可用己知病毒检测相应的血凝抑制性抗体。3试剂和器材
3.1试剂
3.1.1血凝抗原。
3.1.2阴性、阳性恤清。
3.7.3被检血清。
3.1.4鸡红细胞。
3.1.50.85%生理盐水。
3.1.6阿氏液，
3.2器材
3.2.196孔微基血凝板（U型）。3.2.2微量移液器（TD10μl～200μL)及吸头。3.2.3水浴锅。
3.2.4离心机与锥形刻度离心管。4操作程序
4.1抗原血凝效价测定
4.1.110%和0.5%鸡红细胞液的制备4.1.1.1采鸡血：用注射器吸取阿氏液约1mL.取3日龄～10日龄SPF鸡（最少两只），从胸骨尖下方约1.3cm处将注射器针头刺入心脏，吸取心血约2ml.～4ml.，与阿氏液轻轻混合，放入装有10mL阿氏液的离心管中。
4.1.1.2洗涤鸡红细胞：将离心管中的血液经1500r/min～1800r/min离心8min，弃上清液，沉淀物加入阿氏液，轻轻混合后，再经1500r/min~1800r/min离心8min，用吸管移去上清液及沉淀红细国家质量技术监督局1999-11-10批准2000-04-01实施
GB/T 17999.1—1999
胞上层的白细胞薄膜，再重复以上过程后，加入阿氏液20mI.，轻轻混合成红细胞悬液，4C保存5d备用。
4.1.1.310%鸡红细胞悬液：取阿氏液保存不超过5d的红细胞液，在锥形刻度离心管中离心1500r/min～1800r/min8min，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红细胞体积（mL），加入9倍体积（ml.)的生理盐水，用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞均匀混合。4.1.1.40.5%鸡红细胞液：取混合均的10%鸡红细胞悬液1mI.，加入19 ml.生理盐水，合均勾即可。
4.1.2抗原l凝效价测定
4.1.2.1于微量血凝板的A~G排各孔加人生理盐水50μL，Hi与H12孔作为对照，也加入生理盐水50μl。
4.1.2.2A～G排的第1孔加入抗原50μL，每一种抗原的血凝效价测定应作两排检验，如A，与B孔各加入新城疫病毒抗原50μI.;C，与D,孔各加入禽流感病毒（A型)抗原50μL，以此类推。4.1.2.3用微量移液器，从第1孔至第12孔对抗原作系列倍比稀释，即将第1孔的抗原与生理盐水用移液器反复吹吸3次，吸出50μ1移至第2孔，用生理盐水清洗吸头3次后，再用于下一个孔的混合，以此类推，直至第12孔，从第12孔中吸出50μL弃去，此孔抗原的最终稀释度为1：4096。4.1.2.4每孔中加入0.5%鸡红细胞悬液50μL，包括H与H12孔。4.1.2.5将.血凝板置振荡器上中速振荡1min～2min。4.1.2.6置室温(18C~22C)感作 45min。4.1.2.7抗原血凝效价判定：感作完毕，观察血凝板，判读结果（见表1)。表 1血凝试验结果判读标准
孔底所见
红细胞全部凝集，均幻铺于孔底，即100%红细胞凝集红细胞凝集基本冏上，但孔底有大圈红细胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝块红细胞于孔底形成小圆点，四周有少许凝集块红细胞于孔底呈小圆点，边缘光滑整齐，即红细胞完全不凝集结果
能使红细胞完全凝集（100%凝集，十十十十)的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位。注意对照孔应呈现完全不凝集（一），否则此次检验无效。4.2血凝抑制试验
4.2.1被检血清样品准备
4.2.1.1血清灭活：被检血清，包括阳性、阴性血清，56℃C水浴30min～45min，以破坏补体及血凝抑制因子。
4.2.1.2血清的鸡红细胞吸收：检测禽腺病毒Ⅲ群（EDS)时，分别吸取被检血清与对照血清样品300μl于试管中，加入10%鸡红细胞悬液300μL，轻轻混匀，室温（18℃～22℃）感作30min，离心2500r/min10min，此血清稀释度为1：2.4.2.2抗原准备
作血凝抑制试验时各种抗原所用凝单位：禽流感病毒（A型）
传染性支气管炎病毒
新城疫病毒
禽腺病毒严群
鸡毒支源体
滑液護支原体
8个与4个血凝单位
8个与4个血凝单位
16 个与8个血凝单位
8个与4个血凝单位
8个与4个血凝单位
8个与4个血凝单位
GB/T 17999.1—1999
8个血凝单位抗原的配制：如果某抗原的血凝效价为1：1024,8个血凝单位为1024/8=128（即1：128），取生理盐水11.8mL，加入1：10稀释的抗原1.0mL，混合均匀即为1：128稀释液。4.2.3抗原血凝效价的重测定
4.2.3.1为了确证血凝抑制试验时使用抗原的活性，有必要对已配制的8个血凝单位抗原进行血凝效价的再测定，此项试验常与血凝抑制试验同时进行。4.2.3.2A至H各排第1孔分别加入100μL8个而凝单位抗原（新城疫病毒抗原也加8个血凝单位抗原，不要加16个血凝单位抗原）。4.2.3.3各排第28孔各加生理盐水50μl。4.2.3.4将抗原分别作系列倍比稀释至第8孔，从第8孔吸50μI.弃去。4.2.3.5每孔加0.5%鸡红细胞悬液50L。4.2.3.6将血凝板置微量振荡器比中速振荡1min2min4.2.3.7室温（18~22℃）感作45min左右。4.2.3.8观察结果，若血凝单位偏离两个以上稀释度，则血凝抑制试验5效.背血凝单位偏离1个稀释度，属可校正范围，按常规对被检血清的血凝抑制效价进行校正。4.2.4血凝抑制试验
4.2.4.1血凝板每排检测一份被检血清。第1孔分别加入经鸡红细胞吸收过的被检血清40μI，再加人生理盐水60uL；或加入其他未经红细胞吸收过的被检血清20L.再加入生理盐水80μl，每孔的总体积为100μL，被检血清稀释度为1：5。4.2.4.2设阳性血清与阴性血清对照。4.2.4.3每排第2孔分别加入50uL.8个单位抗原（新城疫病毒为50ul.16个血凝单位抗原），第3～11孔加50μL.4个单位抗原（新城疫病毒为50μL8个单位抗原）：4.2.4.4用移液器自第1孔吹吸3次后，取出50μL移至第2孔，以此倍比稀释至第11孔，从11孔吸出50μ.弃去。
4.2.4.5第1孔为血清对照，第2孔被检血清为1：10稀释，第3孔1：20.第4孔1：40，以此类推，第11孔为1：5120。
4.2.4.6每孔加入0.5%鸡红细胞悬液50μl。4.2.4.7将血凝板置微量振荡器上振荡1min2min。4.2.4.8置室温（18C22℃）感作45min左右。4.2.4.9感作完毕，将血凝板倾斜70°，凡沉淀于孔底的红细胞沿倾斜面向下呈线状流动，呈现与红细胞对照孔样者为完全不凝集孔。出现完全不凝集的血清最高稀释度为该被检血清血凝抑制效价5结果判定
禽流感（A型）、新城疫、传染性支气管炎、离腺病毒Ⅱ群（EDS)的血清血凝抑制效价三：10为阳性；鸡毒支原体、滑液囊支原体的血清血凝抑制效价1：80为阳性。69
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