【农业行业标准(NY)】 动物衣原体病诊断技术

ICS 11. 220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T562--2002
动物衣原体病诊断技术
Diagnostic techniques for animal chlamydiosis2002-08-27发布
2002-12-01实施
中华人民共和国农业部发布
NY/T562—2002
衣原体病是由衣原体感染引起的类具有公共卫生意义的自然疫源性疾病。国前已发现鸭、火鸡，鸡、鸽、鹅等140余种禽鸟和数十种哺乳动物，如绵羊、山羊、牛、耗牛、巧、骤、驴、猪、犬、猫、兔、豚鼠、小鼠等可被衣原体感染，表现不同症状或呈亚临床经过。衣原体病病畜禽对人类的健康构成直接威胁，人与病畜禽接触，往往会被感染，表现感冒样症状、眼疾和孕妇流产等。因此加强对本病的口岸检疫具有十分重要的公共卫生学意义。衣原体属包括：鹦鹉热衣原体（Chlanydiapsittaci）、反各动物衣原体（Chluawydiupecorum）、沙眼衣原体（Chlainydiutrachomatis）和肺炎衣原体（Chlamydiapneumoniae），这1种衣原体具有共同的特异性属抗原。引起动物衣原体病的病原主要为鹦鹉热衣原体和反动物衣原体，而沙眼衣原体感染猪一般隐性经过。
在80年代，衣原体病补体结合试验（CF)操作规程和间接血凝试验(IHA）操作规程已被分别纳人农业部颂布的动物检疫规程，多年来被广泛地用于畜禽衣原体病监测和诊断。本标准的附录A、附录B、附录C、附录E和附录F为规范性附录，附录D为资料性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。本标准主要起草人：邱庆、高双娣、周继章、杨学礼。492
1范围
动物衣原体病诊断技术
NY/T562—2002
本标准规定了补体结合试验(CF)的直接法与间接法和间接血凝试验(IHA)技术。本标准的直接补体结合试验（DCF）适用于猪以外的哺乳动物和鹦鹉、鸽（老龄鸽除外）衣原体病的进出境检疫和定性诊断，间接补体结合试验（ICF）适用于禽鸟（鹦鹉、鸽除外·但包括老龄鸽）和猪衣原体病的进出境检疫和定性诊断；IHA试验适用于动物衣原体病的产地检疫、疫情监测和流行病学调查。2补体结合试验(CF）
2.1材料准备
2.1.1器材：12mm×37mm试管、试管架、水浴箱、U型96（8×12)孔微量滴定板、生理盐水。2.1.2补体：商品补体，按说明书使用和保存，试验前对供试补体需经补体效价滴定。补体效价滴定方法见附录A。
2.1.3溶血素：试验前对供试溶血素需经效价滴定。溶血素效价滴定见附录B。2.1.41%绵羊红细胞悬液，制备方法见附录C。敏化红细胞制备见第A.2章。2.1.5被检血清，应无溶血、无腐败（可加入0.01%硫柳汞或0.2%叠氮钠防腐），试验前需灭能。不同畜禽血清灭能的温度和时间见附录D。2.1.6标准抗原和标准阳性、阴性血清（抗原和阳性血清效价滴定的方法见附录E），指示血清。2.2操作方法
2.2.1直接补体结合试验（DCF)（包括试管法和微量法）2.2.1.1试管法
按表1的程序操作。试验要同时设抗补体对照、阳性血清对照、阴性血清对照、抗原对照、溶血素对照和生理盐水对照。
2.2.1.2微量法
用U型96孔反应板，按表2的程序操作。试验同时设抗补体对照、阳性血清对照、阴性血清对照、抗原对照、溶血素对照和生理盐水对照。2.2.1.3DCF试验结果判定
在最后一次37C水浴30min后，立即进行试验结果判定。表1直接补体结合试验（试管法）被检血清
试验管
1：32
抗补体
641：128
1）指示血清：与该抗原相应的哺乳动物抗体，0. 1
2工作量
(1 ： 4)
抗原溶血素
2工作量
单位为毫升
NY/T 562 --2002
2.1作量
2单位
生理盐水
敏化红细胞！
2T作量
2单位
生理盐水
敏化红细胞
+++++++++
被检血清
混匀，4（
表1（续）
抗补体
128㎡1：4
2工作量
抗原溶血素
[2.]作量
16h18h感作，取出后37C水浴30min0.2
混匀，37（水浴30min
被检血清
试验孔
1：16
1：32
混勾，4（
全溶血
全溶血
全溶血全溶血全溶血
直接补体结合试验（微量法）
抗补体
[1：128
(1 : 4)
2工作量
溶血素
2工作量
16 h18h感作，取出后37℃水浴30min50
混匀，37C水浴30min
溶血「溶血
全溶血全溶血
2.2.1.3.1各组对照为如下结果时试验方成立，否则应重复试验：被检血清抗补体对照：完全溶血（一）。阳性血加抗原对照：完全抑制溶血（十十+十)。阴性血清加抗原对照：完全溶血（一）。抗原抗补体对照：完全溶血（一）。溶血素对照：究全溶血（-）。
全溶血全溶血全溶血
单位为毫升
1：32
单位为微升
1：32
生理盐水对照：完全不溶血（十十十十）。2.2.1.3.2判定标准：
a）兔血清：
被检血清效价≥1：16（十+)判为阳性。被检血清效价≤1：8+)判为阴性。NY/T562:2002
被检血清效价=1：16（+)或1：8（十十)判为可疑；重复试验仍为可疑，则判为阳性。绵羊、山羊、牛、幼龄鸽、鹦鹉等血清：b
被检血清效价≥1：8（++)判为阳性。被检血清效价≤1：4（+）判为阴性。被检血清效价=1：8（十）或1：4（十十）判为可疑；重复试验仍为可疑，则判为阳性。2.2.2间接补体结合试验（ICF）（包括试管法和微量法）2.2.2.1试管法
按表3的程序操作。
2.2.2.2微量法
按表4的程序操作。
2.2.2.3结果判定
最后-次37C水浴30min后.立即判定。2.2.2.3.1对照试验为如下结果时试验方可成立.否则应重复试验。被检血清抗补体对照：完全溶血（一）。阳性血清加抗原加指示血清：完全溶血（一）。阴性血清加抗原加指示血清：完全抑制溶血（++++）。抗原抗补体对照：完全溶血（一）。2.2.2.3.2判定标准：
a）鸭血清：
被检血清效价≥1：16（+十)判为阳性。被检血清效价≤1：8（十)判为阴性。被检恤清效价=1：16（+）或1：8（++）判为可疑；重检仍为可疑判为阴性。猪、鸡、鹤鹑等血清：
被检血L清效价≥1：8（++）判为阳性。被检血清效价≤1：4(十)判为阴性。被检血清效价=1：8（+）或1：4（++判为可疑；重检仍为可疑判为阳性。表3间接补体结合试验（试管法）被检血清
1L作量抗原
1工作量
指示血清
试验管
1:81:16
1：32
抗补体
1:641:128
混匀,4℃6h～8 h 感作
间接补反对照
1工作量
直接补
反对照
1工作量
单位为毫升
NY/T 562--2002
2单位补体
生理盐水
敏化红细胞
1工作基抗原
指示血清
2单位补体
生理盐水
敏化红细胞
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试验管
1：16
1：32
表3（续）
抗补体
间接补友对照
1作量
混勾，4（过夜（或8h～10h）.取后37（水浴30min0.2
全溶血全溶血
混勺.37（水浴30min
全溶血全溶血
表4间接补体结合试验（微量法）被检血清
1：16
抗补体
1: 32j1: 64 |1:128
混匀.1℃６h～８h感作
间接补反对照
1工作量
混匀.4C过夜（或8h10h)，取出后37C水浴30min50
全浴血全溶血
3间接血凝试验(IHA)
3.1材料准备
混勺，37（水浴30min
i全溶血全溶血
【商接补
反对照
工作量
单位为毫升
全溶血
1：32
单位为微升
直接补反
指示血清
工作量
全溶血
1：32
3.1.1器材：96孔（8×12)V型（110°）聚苯乙烯滴定板.25μl、50μl.微甘移液器或稀释棒、微量振荡器，水浴箱等。
3.1.2敏化红细胞：为鹦鹉热衣原体纯化灭活抗原致敏的雄性绵羊红细胞对照血清：标准阳性血清的血凝效价为1：2（48~1：4096.标准阴性面清的血凝效价≤1：4。3.7.3
3.1.4被检血清：应光溶血、无腐败.必要时可加人硫柳乘或叠氮钠以防腐，其含量分别为0.01%和496
0.2%。试验前灭能。
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3.1.5稀释液：为含1%灭能健康兔血清的0.15mol/1pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS)。制备方法见附录F。
3.2操作方法
3.2.1稀释被检血清
每份被检血清用8孔，从第1孔开始，至第8孔，每孔滴加稀释液50ulL：用微量移液器或稀释棒吸（蘸）取被检血清50μl.加入第1孔，充分混匀后再吸（蘸）取50μl.加入第2孔.依次做倍比连续稀释至第8孔（1：2，1：4，1：8..1：256）.混勾后从第8孔弃去50叫l.3.2.2加抗原
将抗原摇匀后、从第1孔开始，至第8孔、每孔滴加1%抗原敏化红细胞悬液25以L。3.2.3设对照
在每块V型滴定板上做试验，要同时设立对照.即敏化红细胞空白对照1孔；阳性血清（1：64)加敏化红细胞对照1孔；阴性血清（1：4)加敏化红细胞对照1孔。3.2.4振荡
加致敏红细胞后将V型滴定板放在微量振荡器上振荡「min，置室温（冬季置35C温箱）2h，判定结果。操作程序见表5。
表5间接红细胞凝集试验程序及判定结果举例被检血清稀释度
稀释液
被检血清
敏化红细胞
判定结果
1:161: 32
1:1281：256
放在微量振荡器上振荡1 min，置室温（冬季放 35C温箱）2 h+++++++++++
注：表中所示被检血清的血凝效价为1：128。3.2.5结果判定
3.2.5.1凝集程度的标准：
++→：红细胞100%凝集，成一-均匀的膜布满整个孔底。敏化红
单位为微升
各项对照
十+十：红细胞75%凝集.形成的膜均勾地分布在孔底，低在孔底中心有红细胞形成的一个针尖大小点。
+十：红细胞50%凝集，在孔底形成的薄膜边缘旱锯齿状·孔底为红细胞圆点。+：红细胞25%凝集，孔底红细胞形成的圆点较大。十：红细胞沉于孔底，但周围不光滑或圆点中心有空斑。：红细胞究全沉于孔底，星光滑的大圆点3.2.5.2加抗原后所设各项对照均成立，否则应重做，正确对照的结果是）抗原化红细胞应无自凝（一）。h）阳性血清对照应100%凝集（++++）。阴性血清对照应无凝集（-）。
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3.2.5.3结巢判定：
a）哺乳动物：
血凝效价≥1：64（++)判为阳性。血凝效价≤1：16（+十)判为阴性。血凝效价界于两者之间判为可疑。b)
禽类：
血凝效价≥1：16（十十)判为阳性。血凝效价≤1：4（++)判为阴性。血凝效价界于两者之间判为可疑。可疑者复检，仍为可疑判为阳性。或用CF试验复检A.1
用生理盐水将补体做1：60稀释。附录A
（规范性附录）
补体效价滴定
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A.2敏化红细胞：1%红细胞悬液加等量的2个工作单位量的溶血素、37水浴15min。A.3按表A.1测定补体效价。
表A.1补体效价测定
试管号
2单位抗原
生理盐水
1：60补体
敏化红细胞
0. 0810. 10
混勺，37C水浴30min
溶血溶血
混匀37℃水浴30min
全溶血全溶血全溶血
生理盐水
溶血溶血
单位为毫升
全溶血全溶血全溶血
A.4以能完全溶血的最小补体量为一个单位，正式试验使用两个单位。表A.1例中补体一个单位量为0.12mL,按式（A.1)计算出补体的使用稀释倍数原补体应稀释倍数一使用时每管加人量α滴定时补体稀释倍数一个单位量补体×2
0. 2 X 60
0. 12 X 2
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附录B
（规范性附录）
溶血素效价滴定
B.1先将溶血素1：100稀释（0.2mI.含甘油的溶血素加9.8ml.生理盐水）.按表B.1稀释成不同倍数。
表 B. 1溶血素稀释
稀释倍数
生理盐水
1:100溶血素
1：100溶血素
再按表B.2操作，测定溶血素效价。表B.2
稀释倍数
稀释溶血素
生理盐水
160补体
1%红细胞
10002000
溶血素效价测定
50006000
充分摇匀，37℃水浴30min
全溶血全溶血全溶血全溶血全溶血全溶血|全溶血6
单位为毫升
单位为毫升
1：100
溶血素
红细胞
全溶血
B.3以完全溶血的溶血素最高稀释倍数为-个溶血素单位，表B.2所示为7000倍，正式试验时，使用两个溶血素单位，本例为3500倍。500
附录C
（规范性附录）
1%绵羊红细胞悬液的制备
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C.1从成年健康公绵羊颈静脉采血于灭菌的装有玻璃珠的三角烧瓶中，均匀摇动脱去纤维蛋白，按1：1(V/V)加入红细胞保存液，混匀后分装于灭菌链霉素瓶中（5ml~10mL）,4℃冰箱可保存2个月。使用时，将红细胞移人离心管，1500r/min～2000r/min离心15min，弃上清液，在沉淀中加人生理盐水，摇匀后再离心，如此反复洗红细胞3～4次，直至上清液无色透亮为止，弃上清。取洗涤好的红细胞泥1ml.悬浮于99mL的生理盐水中，即成1%红细胞悬液。C.2红细胞保存液配方：葡萄糖20.5g，氯化钠4.2g，柠檬酸三钠8g，柠酸0.55g，蒸馏水加至1000ml，101.8kPa高压灭菌20min，备用。附录D
（资料性附录）
各种畜禽血清灭能温度和时间
不同畜禽血清火能温度和时间见表D.1,未注明者，血清的灭能温度同时适用于本标准的CF和IHA 试验。
1不同畜禽血清灭能温度和时间
动物种类
豚鼠、火鸡、鸭、鸽、鹅、鹦鹉、鹑黄牛、猪
水牛、山羊、犬（1：2稀释）
马、兔（1：2稀释）
骤、驴（1：2稀释）
灭能温度/C
56(CF)和60(IHA)
灭能时间/min
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E.1测定抗原、血清效价
附录E
（规范性附录）
抗原、阳性血清效价滴定方法
E.1.1取80支试管，排成纵横各9排的方阵（第9排缺1管）。E.1.2抗原和阳性血清分别从1：8~~512作倍比稀释，阴性血清作1：4稀释，设抗原、血清和生理盐水对照。
E.1.3按表E.1加阳性血清，每个稀释度加7管，每管加0.1mL.抗原对照组第1排不加血清，而用0.！ml.生理盐水代替。
E.1.4按表E.1加抗原.每个稀释度加7管，每管加0.1ml血清对照不加抗原，而用0.1ml.生理盐水代替。
E.1.5每管中加人2单位补体0.2mL。E.1.6摇勾.置4（冰箱感作16h～18h，取出放在37C水浴中30min。E.1.7每管加人敏化红细胞0.2mL。E.1.8混匀，置37C水浴30min后，取出静置2h～3h，判定结果。E.1.9效价判定：能与最高稀释度的阳性血清呈现完全抑制溶血（++十-+）反应的最高抗原稀释度，即为抗原效价个.T作量）如表E.1所示，抗原效价为1：128，阳性血清效价为1：256（-个血清工作量）。
抗原和阳性血清滴定举例
1：32
1：64
1：512
血清抗补体
E.2指示血清
1：32
1：512
阴性血清
抗原抗
补体对照
盐水对照
间接补体结合试验所用的指示血清，即直接补体结合试验中的阳性对照血清。其效价如E.1中所测，间接补体结合正式试验时，采用一个血清工作量。E.3间接补体结合试验用阳性血清对照效价的滴定E.3.1先将间接补体结合试验用阳性血清对照（鸭或猪的免疫血清），用生理盐水从1：4至1：512作倍比稀释。抗原和指示血清均稀释成一个工作量，按表E.2程序进行滴定。502
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