【农业行业标准(NY)】 牛传染性鼻气管炎诊断技术

ICS.11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T575—2002
牛传染性鼻气管炎诊断技术
Diagnostic technigues for infectious bovine rhinotracheitis2002-08-27发布
2002~12-01实施
中华人民共和国农业部发布
NY/T575-2002
牛传染性鼻气管炎（infectious bovine rhinotrachcitis、简称IBR）是由牛疱疹病毒1型（I3HV-1）感染家养牛和野生牛引起的一种病毒性传染病，被世界动物卫生组织『World（)rganization forAnimalHealth（英）.Office InternationaidesEpizooties（法），OIE]列为B类疾病，我农业部列为二类动物疫病。该病广泛分布于世界各地，该病死亡率较低，许多感染牛呈亚临床症状经过往往由于细菌继发感染导致更为严重的呼吸道疾病。本标准所规定的技术与(IE推荐的相应技术--致。本标准的附录A、附录B为规范性附录。本标由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归门。本标准起草单位：农业部动物检疫所。本标准主要起草人：封启民、李昌琳、李晓成、李其平。580
1范围
传染性鼻气管炎诊断技术
本标准规定了牛传染性鼻气管炎(IBR)诊断技术要求。NY/T 575--2002
本标准规定的病毒分离方法适用于牛传染性鼻气管炎病毒的分离；微量血清中和试验和酶联免疫吸附试验适用于牛群检疫、流行病学调查及牛群抗体水平的检测。2牛传染性鼻气管炎病毒分离鉴定2.1材料准备
2.1.1病料的采集
2.1.1.1呼吸道拭子：用灭菌拭子伸人鼻道采取分泌物，然后放入含青霉素1000IU/mL，链霉素1000ug/ml..pH7.2的Earles液中。也可用棉拭子刮取眼分泌物，并用相同的方法处理。2.1.1.2阴道拭子：用棉拭子采集脓疱性外阴阴道炎早期病变的阴道黏液，放入含青霉素1000IU/ml.,链霉素1000μg/mL，pH7.2的Earles液中。2.1.1.3脑组织样品：在剖检时无菌采集脑组织。2.1.1.4流产胎儿组织样品：刚死亡的胎儿，无菌采集肺、肾、脾等各种组织样品，放人每1.0mL含有1 000IU青霉素，1000 μg链霉素·pH7.2的Earles液中。2.1.1.5精液：至少采集新鲜精液，或冷冻精液0.5ml，置液氮中保存备用。2.1.2样品的运送
采集的样品立即放人4（冰箱保存，在24h内送到实验室。2.1.3样品处理
2.1.3.1收到棉拭子样品后，先经冻融两次，并充分振动，拧干棉拭子，将样品液经10000r/min离心10min，取上清液作为组织培养的接种分离材料。2.1.3.2组织样品先用Earles液或Hanks液（pH7.2)制成20%的匀浆悬浮液，再经10000r/min离心10min，取上清液作为接种分离材料。2.1.3.3精液冻融两次或超声波裂解，再经10000r/min离心10min，新鲜精液通常对细胞有毒性，在接种前应预先作稀释处理，用Earles液作1：15稀释。2.2操作方法
样品接种：取经处理过的样品0.2mI.接种到已形成良好单层的牛肾或率丸原代或次代细胞培养瓶中。每份样品接种4瓶，于37C吸附1h后，倾去接种液，用Earles液洗三次，最后加人含3%（不含IBR抗体)的特牛血清细胞维持液1mL。置37C培养，逐日观察细胞病变；若7天仍不出现致细胞病变，则收获培养物继代于新制备的细胞上，育传三代后，观察细胞病变，出现病变者收获培养物，保存于一70C待鉴。
2.3病毒鉴定
病毒致细胞病变特点是细胞变圆，聚合，葡萄串状、拉网状.最后脱落。取出现上述病变的细胞培养物，经冻融、裂解两次后，以10000r/min离心10min，取上清再作下列试验。581
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2. 3.1组织培养感染剂量(TCID5)的测定按Reed-Muench方法测定.计算分离物TCID终点。2.3.2分离物作血清中和试验
用1BR标准阳性而清（效价1：32以上）和阴性血清分别与该分离物作中和试验（固定血清-稀释病萍法）按Recd-Muench法分别计算TCIDs。如分离物引起典型的IBR细胞病变，并且经血清中和试验·其阳性血清组和阴性血清组的TCID5对数之≥2.5.则判该分离物为IBR病毒。3微量血清中和试验
3.1材料准备
3.1.1器材
灭菌的96孔细胞培养板，50ul、100μl、300μl，微量移液器，灭菌的塑料滴头，无毒透明胶带（其宽度与培养板·致），灭菌的塑料锥形带盖离心管、倒置显微镜。3.1.2试验材料免费标准bzxz.net
IBRBaitha-Nu/67弱毒株冻干毒，标准阳性血清，标准阴性血清。3.1.3细胞培养液
细胞培养液的配制方法见附录A（规范性附录）。3.1.4细胞
无菌采取犊牛肾或睾丸·按常规胰蛋白酶消化法制备牛肾（BK）或睾丸（BT）细胞，置37C温箱培养，长成良好单层备用，般使用继代细胞，但不超过4代，传代细胞系（MDBK）也可使用。3.1.5病毒抗原制备
将IBRBaitha-Nu/67弱毒株冻干毒用L-E细胞培养液（0.5%水解乳蛋白Earle液）作10倍稀释，长成良好单层的BK或13T细胞瓶，用Earles液洗二次后，按原培养液十分之一量接毒，置37C温箱吸附1h，然后加人pH7.1~7.2内含青素200IU/ml，链霉素200ug/ml.的IE液至原培养液量，37C培养，待80%～90%细胞出现典型的113R病变时收获培养物，冻融两次后，以3000r/min离心20min，其上清液即为病毒抗原。测定病毒滴度（TCIID)）并分装小瓶，每瓶1mL，做好标记和收毒日期，贮存于一70（备用。半年内病毒滴度保持不变。3.1.6病毒滴度测定
将制备的病毒抗原，用pH7.0～7.2I-E液作10倍递增稀释至107，每~~个滴度接种细胞培养板4孔，每孔50μl。随后每孔加人细胞悬液（含50万～60万细胞/ml）100μl和细胞培养液50μl。设4孔细胞对照，用透明胶带封板，置37（培养，观察-一周，每天记录细胞病变情况。50%细胞培养物感染量（TCIDo）：按Reed-Muench方法计算。即TCI)s=50%分数的病毒稀释度的对数+距离比值×稀释系数（10)的对数。高于50%的百分数一50
距离比值一高于50%的古分数一低宇50%的百分数3.1.7被检血清
无菌采集分离珈清，不加任何防腐剂。3.2操作方法
3.2.1血清均于水浴中56C灭活30min。3.2.2将一瓶已知滴度IBR病毒抗原，用pH7.0~~7.2L-F液稀释成含1001CID/50μl.。3.2.3取0.3ml.病毒恐液与等量的被检血清于塑料锥形管（或小试管中）中混合，置37C温箱中和lh。
3.2.4将己和的被检血清-病毒混合物加人培养板孔内，每个样品接种4孔，每孔100ul。582
3.2.5于每-样品孔加人100μl.细胞悬液，用透明胶带封板，置37（温箱培养。3.2.6每次试验时需设以下对照。NY/T575---2002
标准阳性血清加抗原和标准阴性血清加抗源对照，其操作程序间3.2.4、3.2.5；a
b）被检血清毒性对照：每份被检血清样品接种2孔，每孔50μl.再加细胞悬液100μl；c）细胞对照：每孔加100μl.细胞悬液，再加细胞培养液100μl，3.2.7实际使用病毒抗原.T作量测定。将病毒抗原T作液（100TCII）/50μL）作10倍递增稀释至10，取病萨抗原工作液及每个稀释度接种4孔，每孔50ul，加细胞培养液50μl，再加细胞悬液100μl.，按Recd-Muench方法，计算本次试验TCIDsm/50uL的实际含量3.3结果判定
3.3.1判定方法
接种后72h判定结果。当病毒抗原工作液对照，标准阴性血清对照均出现典型细胞病变；标准阳性血清对照无细胞病变.被检血清对细胞无毒性，细胞对照正常，病毒抗原实际含量在30TCID5～300TCIID时，方能判定，否则被认为无效。3.3.2判定标准
未经稀释的被检血清能使50%或50%以上细胞孔不出现病变者判为阳性。4酶联免疫吸附试验
4.1材料准备
4.1.1抗原
标准阴性血清，阳性血清和抗牛免疫球蛋白-辣根过氧化物酶标记抗体。4.1.2溶液
抗原包被缓冲液、封闭液、洗涤液、底物溶液和终止液，配制方法见附录B（规范性附录）。4.1.3器材
聚苯乙烯酶标反应板，酶标仪微量可调移液器（20μl.～200ml）和滴头。4.2操作方法
4.2.1抗原包被
用包被缓冲液将抗原稀释至：1作浓度包被反应板，每孔150μl，4（包被12h，包被板置4（下30d内均可使用。
4.2.2洗板
甩掉孔内的包被液，注满洗涤液，博甩于，如此连续操作五遍。4.2.3封闭
每孔注满封闭液，置37C封闭90min，然后按4.2.2洗涤。4.2.4加样
标准阴、阳性而清和被检血清均用封闭液作100倍稀释，每份被检血清加2孔，每孔150μL。每块板均设标准阴、阳性血清及稀释液对照各2孔。加样完毕后封板，放37（孵育1h，再按4.2.2洗涤。4.2.5加酶标记抗体
每孔加人用封闭液稀释至工作浓度的酶标记抗体150μl。置37（再孵育1h，按4.2.2洗涤。4.2.6加底物
每孔加底物溶液150ul，置室温（20C左右）避光反应20min。4.2.7终止反应
每孔加终止液25μul.。
4.3结果判定
4.3.1P/N比法：被检样品（P)的吸光度值和阴性标准样品（N)值之比583
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2.0P/N1.50
判为阴性
判为可疑
判为阳性
自视比色法：被检血清孔近于或浅于标准阴性血清孔者判为阴性；略深于标准阴性血清孔者判为可疑；明显深于标准阴性血清孔者判为阳性。3凡可疑被检血清均应重检，仍为可疑时.则判为阴性。4.3.3
最低要素培养基（MEM）
0.5%水解乳蛋自-Earle's液（L-E)特牛血清
谷氨酰胺
青、链藓素
附录A
（规范性附录）
细胞培养液配制
200 IU/ml
混含后用碳酸氢钠（NaHC),)调至>H6.8~7.0。附录B
（规范性附录）
酶联免疫吸附试验试剂的配制
B.1包被缓冲液（pH9.6碳酸盐缓冲液）碳酸钠(NaCO，）
碳酸氢钠（NaHC)）
氯化钠（NaCI）
加无离子水至1000ml。
B.2洗涤液（pH7.4.0.05%吐温-磷酸盐缓冲液）磷酸二氮钾（KHPO）
磷酸氢二钠(NazHPO，·12H,O)
氯化钾(KC1)
氯化钠（NaCI）
吐温-20(Tween-20）
加尤离子水至1000mL。
B.3封闭液的配制
三羧甲基氨基甲烷(Tirs）
氯化钠（NaCl）
乙二胺四乙酸二钠（EDTA）
加无离子水至1000ml。
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用1mo1/L盐酸调pH至7.4，临用前加人吐温-20（Twccn-20）和健康马血清，使终浓度分别达0. 1%和3%
B.4底物溶液
磷酸氢二钠(Na,HPO,）
柠檬酸(CHO：·HO)
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加无离子水至1000ml。
临用前称40mg邻苯二胺溶解在100mL上述溶液中，完全溶解后再加0.15μL3%过氧化氢（H)），泥合后立即使用。
5终止液【2mol/L硫酸（H2SO.)的配制B.5
浓硫酸
无离子水
177.8 ml.
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