【农业行业标准(NY)】 兔出血性败血症诊断技术

ICS 11. 220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 567.--2002
免出血性败血症诊断技术
Diagnostic techniques for rabbit haemorrhagic septicemia2002-08-27发布
2002-12-01实施
中华人民共和国农业部发布
NY/T567--2002
兔血性败迦症（rabbithaemorrhagic septicemia）又称兔多杀性巴氏杆菌病，是家免的一种重要的呼吸道传染病。本病主要引起家免的出血性坏死性肺炎，多呈最急性或急性病程迅速死亡，也有的表现为慢性、局部性病变，如结膜炎、鼻炎等。本病可发生于任何年龄的家兔，尤其在集约化养免场，一旦发生会造成重大经济损失。
本标准采用的技术与世界动物卫生组织［WorldOrganization forAnimal Health（英），OfficeIntentional desEpizootic（法），(IE］推荐的其他动物巴氏杆菌病诊断技术基本--致，本标准是参考这些技术，根据本国的研究和诊断实践经验制定的。本标准的附录A为规范性附录。
本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：江苏省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：主启明、董亚芳。536
1范围
兔出血性败血症诊断技术
本标准规定了兔出血性败血症(兔巴氏杆菌病)的诊断技术。本标准适用于本病的病原学诊断和产地检疫。2规范性引用文件
NY/T 567 --2002wwW.bzxz.Net
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB4789.281994食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB3/T14926.52001实验动物多杀巴斯德杆菌检测方法NY/T564--2002猪巴氏杆菌病诊断技术3材料和试剂
3.1培养基：马丁琼脂、玛丁肉汤，制备方法见附录A。3.216g~~20g重实验动物小白鼠。4检验程序
检验程序见图1。
血琼脂平血
36c±1c24 h~48
马丁琼脂平皿（分纯）
36c±irt18 h~24h
涂片镜检
45°折光显微镜检查
麦康凯琼脂平血
生化试验
动物试验
图1检验程序流程图
NY/T567—2002
5检验具体步骤
5.1采样
采取鼻咽部或气管分泌物；肺等病灶或心血。5.2分离培养
将样品划线接种于血琼脂（见GB4789.28一1994中4.6）平Ⅲ，并置其于36C士1C温箱培养24h～48h，挑选灰白色、不溶血、光滑露滴样菌落转种于马丁琼脂（见第A.1章）平皿，置36（土1C温箱培养18h～24h，挑选半透明圆润露珠状、直径1mm～2mm左右的菌落，在45°折光显微镜下观察，可见周边带绿色荧光的黄红色Fo型菌落，可用于生化鉴定。多杀性巴氏杆菌在麦康凯琼脂（见GB4789.28 --1994中4.24)平Ⅲ上不生长。5.3形态与染色
按GB/T14926.5--2001中5.3规定进行。5.4接种高层三糖铁琼脂斜面
按GI/T14926.5—2001中5.4规定进行。5.5生化试验
按GB/T14926.52001中5.5规定进行。6动物试验
6.1自5.2马丁琼脂平Ⅲ上挑取分离纯粹的多杀性巴氏杆菌标准单个菌落4~~5个，接种于马丁肉汤（见第A.2章）中试管内，置36C±1C温箱内培养18h~~24h，菌液含活菌数约在8千万/mL～1.2亿个/ml.。
6.2将上述菌液经稀释后腹腔注射小白鼠3只，每只约为1000个菌体，小自鼠应于7日内死亡，并自心血中分离出原接种菌，以证实分离菌有致病力。7结果判定
根据以上生物特性、生化试验和动物试验的结果进行判定，结果与5.2～5.5及第6章规定的情况相符时作出阳性报告，不符合者作出阴性报告。8血清群和血清型鉴定
有两种血清学试验，作为有条件实验室选做项目，以进行更精确的细菌学鉴定。试验程序见NY/T5642002中第4章。
A.1马丁琼脂制备方法
牛肉汤
猪胃消化液
A.1.1牛肉汤
A.1.1.1成分
A.1.1.2制法
附录A
（规范性附录）
培养基的配制
20 g～25 g
将除去脂肪、筋膜的牛肉，用绞肉机绞碎，按上述比例混合、搅拌均勺。NY/T 567--2002
盛放于不锈钢锅，加温至65C~75C.保持45min，继续加热至煮沸，保持1h。全过程中均应不断搅拌。
煮沸完成后·捞出肉渣，沉淀30min，取上清液经白棉布过滤.将滤过的肉汤与从肉渣中压榨出的肉汤混合使用。
A.1.2猪胃消化液
A.1.2.1成分
盐酸(HCI)（化学纯.密度1.18g/mL）水
A.1.2.2制法
将除去脂肪的猪胃用绞肉机绞碎。300g
1 000 ml
按上述比例加人65C温水混合均匀，再加入盐酸，使pH为1.6～2.0.保持消化液51（～55C消化18 h～~24 h。
在消化过程的前12h至少揽拌6～10次，然后静置。以利胃组织溶解。液体澄清为消化完全与否的标志，如消化不完全，可酌情延长消化时间。除去脂肪和浮物，抽取清液煮沸3min～5min，放缸内静置沉淀4&h再使用或加2mol/L氢氧化钠(NaO)H)调至pH6.0左右，经灭菌贮存备用即可。按A.1.1和A，1.2按比例混合，加琼脂后（除琼脂粉外，使用其他琼脂时须以流水充分冲洗并拧干）.加热溶解。
待琼脂完全溶化后，以2mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液调整pH为7.4～7.6。以凝固沉淀法除去沉淀。
分装于中性玻璃瓶中，以68.94kPa高压灭菌30min。灭菌完毕，立即测定pH,应为7.2～7.6。根据需要，以无菌操作将健康无菌牛血清4%，加人到冷至50（左右的琼脂中，充分混合后，分装于平血中，即为含4%血清马丁琼脂平Ⅲ。经37（培养24h～48h，应无菌生长。539
NY/T 567—2002
马丁肉汤制备方法
牛肉汤（见A.1.1)
猪胃消化液（见A.1.2）
将上述材料混合后，用2·mol/L氢氧化钠（NaOH)溶液调pH为7.4～7.6，以68.9kPa高压灭菌30min或按需用量分装小瓶或试管后再以68.94kPa高压灭菌30min，即为马丁肉汤。经37C培养24h~48h，应无菌生长。540
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