【农业行业标准(NY)】 鸡传染性鼻炎诊断技术

ICS 11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 538—2002
鸡传染性鼻炎诊断技术
Diagnostic techniques for infectious coryza2002-08-27发布
2002-12-01实施
中华人民共和国农业部发布
NY/T538--2002
鸡传染性鼻炎（IC)是由副鸡嗜血杆菌(hpg)引起的一种鸡的急性上呼吸道传染病，本病在世界各地均有发生，主要引起蛋鸡产蛋率下降、生长发育鸡群的生长受阻及淘汰率增加，造成很大的经济损失。副鸡嗜血杆菌通常分为A、B、C三个血清型,在我国能引起传染性鼻炎的菌型目前为A型和C型，它们具有共同抗原和各自的型特异性抗原，可以通过检测这些型特异性抗原来鉴定hpg的血清型。本标准提供了多种诊断鸡传染性鼻炎的方法，在使用中应根据鸡群发病后至诊断时的间隔时间长短及使用单位的具体情况选择使用。建议在鸡群发病早期采用病原的分离鉴定或聚合酶链反应（PCR）方法进行诊断，感染一周以后可以采用血清平板凝集试验进行诊断，两周后可以采用琼脂扩散试验、间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和阻断ELSIA进行诊断，三周后以上各种检查抗体的方法均可使用。本标准的附录 A、附录B、附录 C、附录 D、附录E、附录 F为规范性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：北京市农林科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：苗得园、陈小玲、张培君、陈葵、宋程、龚玉梅。316
1范围
鸡传染性鼻炎诊断技术
NY/T538—2002
本标准规定了检测副鸡嗜血杆菌的细菌分离鉴定方法、PCR技术以及检测副鸡嗜血杆菌特异性抗体的血清平板凝集试验、血凝抑制试验、间接酶联免疫吸附试验、阻断酶联免疫吸附试验的操作方法。本标准适用于鸡和其他易感动物的传染性鼻炎的诊断。2细菡的分离鉴定
2.1材料准备
2.1.1无菌棉拭子、鲜血琼脂平板培养基。2.1.2产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（或辅酶I,NAD)表皮葡萄球菌。2.2操作程序
2.2.1无菌打开可疑病鸡的眶下窦，用灭菌棉拭子蘸取其中粘液或浆液。2.2.2用棉子在鲜血琼脂平Ⅲ上横向划线5～7条，然后取产NAD表皮葡萄球菌从横线中间划一纵线。
2.2.3将划种好的平皿置于5%的二氧化碳（CO,)培养箱中37℃培养18h～24h。2.2.4观察菌落特点。
2.2.5取分离物做过氧化氢酶试验，必要时通过进一步的生化反应做详细的特征鉴定。副鸡嗜血杆菌的生化反应特点及过氧化氢酶试验方法见附录A。2.2.6也可采用PCR鉴定可疑菌落，同时取病料或可疑菌落进行动物试验，方法见附录B。2.3结果判定与表示方法
若鲜血琼脂培养基上出现“卫星样”生长的露滴状、针头大小的小菌落，即靠近产NAD表皮葡萄球菌线处菌落较大，直径可达0.3mm，离产NAD表皮葡萄球菌线越远，菌落越小，过氧化氢阴性，结果判为阳性，记为“十”，若无卫星现象，但有露滴状、针头大小的小菌落出现且过氧化氢酶阴性，则仍需采用PCR或动物试验鉴定，以避免漏检不需NAD的副鸡嗜血杆菌。若无上述现象，则判为阴性，记为“_\。
3聚合酶链反应（PCR）技术
3.1材料准备
3.1.1PCR反应液、消化液、阴、阳性对照物,按说明书保存和使用。3.1.2石蜡油、生理盐水、蒸馏水、1.5mL及0.5mL小离心管、吸头若干，均经灭菌处理。3.1.3PCR仪、56C水浴锅、微量加样器、小型高速离心机、冰块等。3.1.4琼脂糖、电泳仪、水平电泳槽、紫外检测仪3.1.510mg/mL漠化乙锭，加样缓冲液，TAE电泳缓冲液，配制方法见附录C。3.2操作程序
3.2.1PCR临床样品的采集
无菌打开可疑病鸡的眶下窦，用灭菌棉拭子蘸取其中粘液或浆液，浸入含0.8mL～1.0ml生理盐水的1.5mL离心管内，室温放置0.5h后，将棉拭子在管壁上尽量挤干，然后弃至消毒液缸中。317
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3.2.2PCR临床样品的预处理
将浸过棉拭子的离心管以8000r/min～10000r/min离心10min，小心吸去大部分上清液，保留20ul左右液体（若原始样品中混有血液，可2000r/min离心3min～5min，使血球沉于管底，将上清液转到新管里，再高速离心）。经上述处理过的样品，可开始消化，或在一20℃保存。3.2.3PCR临床样品消化
用吸头将离心管中沉淀物与剩余液体混合均匀，从中取1μL置于含9μLPCR消化液的0.5mL小离心管中（注意：做不同样品时应换吸头），然后压紧离心管盖，56℃水浴1h，然后95℃10min，再冰浴10min后进行PCR扩增或置一20℃保存。3.2.4PCR菌落样品制备
挑取平血上的可疑菌落，加到含10μL蒸馏水的0.5mL的小离心管中，压紧管盖，95℃加热10min，再冰浴10min后进行PCR扩增或一20℃保存。3.2.5PCR阴阳性对照样品制备
用10μl.消化液作为阴性对照样品，用9μL消化液加1μL已知阳性对照物作为阳性对照样品。56℃水浴1h，然后95℃10min，再冰浴10min后进行PCR扩增或置一20℃保存。3.2. 6 PCR 扩增
将样品管瞬时离心，使附着于管顶、壁上的液滴沉下，然后加入15uLPCR反应液，使总体积为25μL。再瞬时离心，然后加人50μL矿物油覆盖，置PCR仪上进行扩增反应。程序为94℃1min、65℃1min、72℃2min循环25次;94℃1min、65℃1min、72℃10min循环一次。3.2.7琼脂糖凝胶电泳
按照附录D制备0.7%的琼脂糖凝胶，从各PCR反应管中分别取10μL反应产物与2μL加样缓冲液混合均匀，然后加人到样品孔中。初次操作时应设置DNA分子量对照，60V～80V稳压电泳30min-~50min，至加样缓冲液的染料带走出2cm3cm时停止电泳。3.2.8结果
在紫外检测仪下观察结果，必要时可拍照保存。3.3结果判定与表示方法
阳性对照样品应呈现一条0.5kb的DNA带，阴性对照样品不应有这条带，被检样品若出现与阳性对照同样大小的一条DNA带，则判为阳性，记作“十”，若无此带，则判为阴性，记为“”。阴、阳性对照应分别出现阴、阳性结果，否则，全部样品应该重做。4血清平板凝集试验
4.1材料准备
4.1.1鸡传染性鼻炎平板凝集试验抗原、阴、阳性对照血清，按说明书保存和使用，使用前与被检血清一起恢复至室温，
4.1.2试验用玻板（也可用载玻片）、可调微量加样器1个、灭菌吸头若干、记号笔。4.2操作程序
4.2.1本试验在室温（20℃~25℃)进行。4.2.2先在玻板背面写好编号，每个样品间至少留20mm空隙，再在每个序号边加抗原15μL。4.2.3按玻板上的序号加对照或被检血清15uL，每个血清样品换一个吸头，将血清与抗原混匀，反应持续3 min～5min，在此时间内观察结果。每次试验均设阴、阳性对照。4.2.4在黑色背景或在灯下明亮处观察并记录结果。4.3结果判定与表示方法
判定标准见表1。
表1血清平板凝集试验判定标准
反应表现
有明显絮状或片状凝集片，液体清亮有大量针头样颗粒，量多，液体较清亮针头样颗粒状，量较少，稍混浊液体无颗粒，均匀而混浊
出现1、2、3号反应者为阳性，出现4号反应者为阴性。5血凝抑制试验
5.1材料准备
强阳性
弱阳性
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记录符号
5.1.1鸡传染性鼻炎血凝抑制试验抗原、阴、阳性对照血清，按说明书保存和使用。5.1.2生理盐水及被检血清。
5.1.3新鲜红血球悬液及醛化红血球悬液，制备方法见附录E。5.1.496孔微量血凝板（V型）、微量振荡器、微量加样器及吸头若干。定性区分
5.2操作程序
5.2.1本操作最好在20℃～25℃范围内进行，同时用A、B、C型抗原分别对被检血清进行以下操作，以全面检出各型菌的感染。
5.2.2取洁净血凝板，将抗原用生理盐水从5倍开始做两倍递增稀释加人1～11列孔中（即第1列孔为5×，第2列为10×，第3列为20×，依此类推至第11列），每孔最终液体量为100μL，第12列孔只加生理盐水作为血球对照孔。
5.2.3每孔加1%醛化红血球（A型抗原可用新鲜红血球）100μL。5.2.4充分振荡混合后，在室温静置30min~60min（至血球对照孔中红血球完全沉下为准）。5.2.5判定抗原的血凝价（HA效价）。即为使红血球发生完全凝集的抗原最大稀释倍数。5.2.6被检血清的吸收：将被检血清用10%的鸡醛化红血球做5倍稀释，室温下作用4h或4℃过夜，中间充分振荡不少于5次，然后1500r/min离心10min，取上清液即为5倍稀释的被检血清。5.2.7取洁净血凝板，从第1列孔开始，用生理盐水将每份被检血清及阴、阳性对照血清从5倍开始做两倍递增系列稀释，每行测定一份血清，每孔最终液体量为50μL。5.2.8将抗原用生理盐水稀释至浓度为4个HA效价单位（如HA效价为1：160，则抗原稀释至40倍），每血清孔中加人50μL。5.2.9充分振荡，于室温下感做30min以上。5.2.10每孔加人1%的醛化红血球100μL（A型抗原可加新鲜红血球）。5.2.11充分振荡，置室温下作用30min～~60min。5.2.12分别判定被检血清样品血凝抑制(H1)效价，即完全抑制红血球凝集的最高血清稀释倍数。5.3结果的判定与衰示方法
能完全抑制红血球凝集者判为阳性(HI效价≥5),阴、阳性对照血清的结果应分别为阴性和阳性。6琼脂双向双扩散试验
6.1材料准备
6.1.1鸡传染性鼻炎琼脂扩散试验抗原、阴、阳性对照血清，按说明书保存和使用。6.1.2琼脂糖：含0.01%硫柳汞、8%氯化钠的磷酸盐缓冲液(PBS)(0.01mol/LpH7.4)。6.1.3微量加样器及吸头若干、打孔器、针头。319
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6.2操作程序
6.2.1琼脂板的制备：取琼脂糖1.0g，加到100mL含硫柳汞的PBS溶液中加热熔化，待冷却至45℃～50℃时倒平皿，厚度3mm左右，注意勿倒出气泡。6.2.2打孔：先在纸上画好梅花形的七孔图（见图1）。将含琼脂的平皿放置图上，用金属打孔器在琼脂上打孔，每孔直径5mm，孔距3mm，打孔后吸出或挑出孔内琼脂块，然后将平Ⅲ置酒精灯上微微加热封底。
图1梅花形七孔示意图
6.2.3加样：用微量加样器吸取抗原滴加于其余中央孔，取等量阳性血清对照分别加到1、4孔，被检血清分别滴加于周边孔（可将被检血清系列稀释加人不同孔中测其琼扩效价）。各孔以加满不溢出为度。每次试验可设1～2孔阴性对照。
6.3结果判定与表示方法
在黑色背景或灯光下观察结果，阳性血清对照孔与抗原之间应出现清晰的沉淀线，阴性对照孔与抗原之间则不应出现沉淀线。被检血清孔与抗原孔之间出现沉淀线且沉淀线与阳性对照孔的沉淀线末端相融合者判为阳性，被检血清孔与抗原孔间虽无沉淀线，但阳性血清沉淀线向被检血清孔弯曲（屑弯）者判为弱阳性，均记为“十”，被检血清孔与抗原孔之间无沉淀线且标准阳性血清与抗原孔之间沉淀线直伸到被检血清孔的边缘，则判为阴性，被检血清孔与抗原孔之间形成沉淀线但与标准阳性血清与抗原孔之间沉淀线末端不相融合者判为阴性，均记为“一”。7间接酶联免疫吸附试验（I-ELISA）7.1材料准备
7.1.1鸡传染性鼻炎ELISA抗原，阴、阳性对照血清、羊抗鸡IgG酶标抗体，按说明书保存和使用。7.1.2洗涤液、包被液、底物液及终止液，以上各溶液配制方法见附录F。7.1.3稀释液：成分与配制方法同7.1.2中洗涤液。7.1.4ELISA读数仪、微量加样器（单道及多道）、37℃C恒温培养箱、酶标板、4℃冰箱、吸头若干。7.2操作程序
7.2.1抗原包被：将抗原用包被液稀释至工作浓度，加人酶标板各孔中，每孔100uL，置4℃冰箱过夜。7.2.2洗涤：甩净孔内抗原溶液，用洗涤液加满各孔，放置5min，然后甩净，如此重复3次。7.2.3加被检血清：用稀释液将被检血清做1：100稀释，每孔加人100μL，每次操作均设置阴性对照孔两个，阳性对照孔、空白对照孔各一个，分别加人同样稀释的阴、阳性血清和稀释液各100μL，加不同的血清样品时应换吸头，37℃温箱中作用30min。7.2.4洗涤：同7.2.2。
7.2.5加羊抗鸡IgG酶标抗体：用稀释液将酶标抗体稀释至工作浓度，每孔加人100μL，37℃温箱中作用30 min。
7.2.6洗涤：同7.2.2。
7.2.7显色：加入底物液100uL，室温避光反应5min左右（至阴性对照孔开始产生颜色时）。7.2.8终止及读数：每孔加50uL终止液终止显色，然后用ELISA读数仪读取每孔在492nm处的吸320
光度(OD)值。
7.3结果判定与表示方法
将样品的OD值代人式（1)计算：被检血清样品OD值
荫性对照平均OD值
式中：
S—被检血清样品OD值；
N——阴性对照平均OD值。
若S/N2则结果判为阳性，记为“十”，否则判为阴性，记为””。8阻断酶联免疫吸附试验（B-ELISA）8.1材料准备
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·（1）
8.1.1鸡传染性鼻炎A、C型ELISA抗原，A.C型单抗，羊抗鼠IgG酶标抗体，阴、阳性对照血清，按说明书保存和使用。
8.1.2包被液、洗涤液、底物液、终止液配制方法筒7.1.2。8.1.3稀释液：洗涤液中加人5%的脱脂奶粉，用于稀释单抗和羊抗鼠IgG酶标抗体。8.2操作程序
8.2.1抗原包被：将A、C型抗原用包被缓冲液稀释至工作浓度后分别包被相同数目的孔（或板），每孔加50uL，加不同型抗原时需换吸头，每次操作均设一调零孔，只加入底物液和终止液，用以读数时调零。加入抗原后，轻振板几次，使抗原液在孔底均勾铺开，做好相应标记，置4℃冰箱过夜。8.2.2洗涤：甩净孔内抗原溶液，用洗涤液加满各孔，放置5min，然后甩净，如此重复3次。8.2.3加被检血清：将每个被检血清样品，先取50uL加人A型抗原包被孔，再取50uL加人C型抗原包被孔，另外在A、C型抗原包被孔中各取四孔，分别加人A、C型阳性对照血清和两份阴性对照血清各50μL.作为对照，加不同血清样品时应换吸头，置37℃温箱作用60min。8.2.4洗涤：同8.2.2。
8.2.5加A、C型单抗：用稀释液将A、C型单抗稀释至工作浓度，在各A型抗原包被孔中加人A型单抗50μL，C型抗原包被孔中加C型单抗50μL，加不同型单抗时需换吸头，加完后，置37℃温箱作用60 min。
8.2.6洗涤：同8.2.2。
8.2.7加酶标抗体：将羊抗鼠IgG酶标抗体用稀释液稀释至规定浓度，每孔加人50uL，37℃温箱中作用60min。
8.2.8洗涤：同8.2.2。
8.2.9加底物：加人新配制的底物液50μL，显色10min～15min，至阳性对照孔开始出现颜色时。8.2.10终止：加人终止液50μL，终止显色。8.2.11读数：放人ELISA读数仪内，以调零孔调零，读取每孔在492nm波长的OD值。321
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3结果判定与表示方法
将被检样品OD值和阴性对照平均OD值代人式(2),计算阻断率。阻断率（%）= 100 — 100 ×
被检血清样品OD值
阴性对照平均 OD 值
若阻断率50%则判为阳性，记作十”,否则判为阴性，记作“详细记录方式见表2。
阻断ELISA结果判定表
同一血清对 A,C 单抗阻断率
A≥50% C≥50%
A<50% C≥50%
A≥50%
A<50% C<50%
.0....0( 2)
A.1原理
附录A
（规范性附录）
副鸡嗜血杆菌的过氧化氧酶试验过氧化氢酶可把过氧化氢分解为水和氧。2H,02
过氧化氢酶
+2H20+02 1
A.1.1方法：在A，1.2及A.1.3所述方法中任选一种。NY/T538—2002
A.1.2取一滴3%的过氧化氢，放在玻片上，然后用接种环由固体培养基取菌苔一环，加到玻片上与试剂混合，如有大量气泡者即为阳性反应。A.1.3先取3%的过氧化氢1mL放入小试管内，然后从琼脂斜面（不含血液）取一环细菌放人试管内，有大量气泡者即为阳性反应。A.2副鸡嗜血杆菌与禽嗜血杆菌生化特性鉴定见表A,1。
过氧化氢酶
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β-半乳糖苷酶
阿拉伯胶糖
半乳糖
麦芽糖
海藻糖
甘露醇
山梨醇
副鸡嗜血杆菌
禽嗜血杆菌
注1：所有菌为革兰氏阴性，需要√因子，不需要×因子。注2：“十”为阳性，“
”为阴性，V为可变。
禽巴氏杆菌
鸟巴氏杆菌
巴氏杆菌A种
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B.1材料准备
附录B
（规范性附录）
动物试验
生理盐水、注射器、5针头、1.5ml小离心管、棉拭子，以上材料均需灭菌处理。4只4周龄以上的易感健康鸡或无特定病原(SPF)鸡。B.2操作程序
B.2.1无菌打开可疑病鸡的眶下窦，用灭菌棉拭子尽量多地蘸取其中粘液或分泌物，然后将拭子浸人盛有1mL生理盐水的小离心管中，搅动挤压棉子数次，使粘液进入生理盐水，弃去棉拭子（消毒处理以避免污染），即获得临床病料液，挑取经病料接种生长的可疑菌落做成菌悬液或直接取肉汤培养物作为病料样品。
B.2.2将上述病料0.2mL~~0.3mL接种健康易感鸡或SPF鸡下窦，并于接种后逐日进行临床观察，出现鼻炎症状者扑杀观察病变，直至一周。B.3结果判定与表示方法
若接种鸡出现典型的传染性鼻炎症状和病变后，判为阳性，记为“+”，若无传染性鼻炎症状和病变；则判为阴性，记为“”。一般阳性病料在24h~48 h后可出现典型鼻炎症状，当分泌物含活菌太少或慢性病例，潜伏期可延长至一周。附录C
（规范性附录）
聚合酶链(PCR)试验常用溶液配制C. 1 50倍 TAE 缓冲液：
三羟甲基氨基甲烷(Tris）
冰乙酸
0.5 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)加蒸馏水至1000mL
使用时用蒸馏水做50倍稀释。
2加样缓冲液
溴酚蓝
0.5mol/I.pH6.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HC1)缓冲液C.310mg/mL澳化乙锭
溴化乙锭
水(H20)
100 mL
附录D
（规范性附录）
PCR 琼脂糖凝胶的制备
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D.1称取琼脂糖0.7g放人三角瓶中，加人100mL的1倍TAE缓冲液，将三角瓶放在沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖充分溶解（注意用微波炉加热时不要沸出），置室温冷却至50℃左右，加人10mg/ml的溴化乙锭10μL，混勾。
D.2将洁净胶槽放置水平台上，先吸取少量胶液封住胶槽两端挡板下面空隙，垂直于槽面放入塑料制“梳子”，“梳子”距槽底面的1mm左右（切勿接触）。D.3将胶液倒在槽底中央，让胶液自由流向各方,倒胶量控制在胶厚3mm～4mm为宜，倒胶一次完成，中途不要停顿。
D.4胶倒好后，自然充分冷却，然后慢慢拔出“梳子”,注意勿弄坏胶孔。D.5将胶槽两端挡板取下，放入电泳槽，加人1倍TAE缓冲液至溶液没过胶面1cm，样品槽中也充满缓冲液。
D.6将槽连到电泳仪上，点样后开始电泳。附录E
（规范性附录）
新鲜红血球和醛化红血球的制备E.1阿氏液
葡萄糖
柠檬酸钠
柠檬酸
氯化钠
蒸馏水加至
1000mL
1064kPa30min高压灭菌，4℃冰箱保存备用。E.21%新鲜红血球的制备
采取鸡血与阿氏液1：1混合用生理盐水离心洗涤5次，每次1500r/min，10min，去上清，沉淀下来的红血球按1mL加人99mL生理盐水进行悬浮。E.310%醛化红血球的制备
采鸡血与阿氏液1：1混合，用生理盐水离心洗涤5次，每次1500r/min，10min，将沉淀的红血球吸起，用0.2mol/LpH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)配成红血球悬液，按24：1加人戊二醛储存液（25%）迅速混合，置4℃搅拌30min～45min，再用生理盐水离心洗涤5次，去离子水洗涤5次，方法同上，最后一次将沉淀红血球用PBS配成10%悬液，加人0.01%的硫柳汞4℃冰箱避光保存。·个月内使用。325
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附录F
（规范性附录）
ELISA 常用溶液的配制
F.1包被缓冲液（0.05mol/L的碳酸盐缓冲液）碳酸钠
碳酸氢钠
加蒸馏水至
112kPa20min高压灭菌，4℃保存备用。F.2洗涤缓冲液
氯化钠
磷酸氢钾
磷酸氢二钾(Na2HPO4·12H,O)
氯化钾
吐温-20
加蒸馏水至
112kPa20min高压灭菌，4℃保存备用。F.3
底物缓冲液
磷酸氢二钾（Na2HPO4·12H,O)
柠檬酸
加蒸馏水至
106.4kPa30min灭菌，4℃保存备用。1.59g
1000mL
1000mL
1000 mL
用前每100mL.中加人40mg邻苯二胺，溶解后加入30%的双氧水150uL，混勾使用。F.4终止液（2 mol/L硫酸溶液）硫酸（95%～98%）
蒸馏水
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