【国家标准(GB)】 医用输液,输血,注射器具检验方法 第二部分:生物试验方法

中华人民共和国国家标准
医用输液、输血、注射器具检验方法第二部分：生物试验方法
Infusion, transfusion, injction equipment for medicaluse-Part 2: Biological test methods1主题内容与适用范围
GB/T 14233.2---93
本标准规定了医用输液、输血、注射器具成品及材料的生物性能试验方法。本标准适用于医用高分子材料制成的医用输液、输血、注射及其配套器具生物性能试验。其他医用高分子制品亦可参照采用。第一篇成品试验
2无菌试验
2.1定义
无菌试验系指检查供试品是否无菌的一种方法。2.2主要设备
超净工作台、光学显微镜、恒温培养箱、压力蒸汽灭菌器、电热干燥箱。2.3试剂
蛋白陈、牛肉膏、酵母膏、琼脂、葡萄糖、磷酸二氢钾、氟化钠、氢氧化钠、硫酸镁、胰酶酪、陈、L-胱氨酸、硫乙醇酸钠、0.9%氯化钠注射液。2.4培养基
2.4.1培养基制备
2.4.1.1培养基所用的陈、牛肉膏、酵母膏、琼脂先配少量培养基观察其灭菌后是否有混浊，长菌情况是否良好。在更换厂牌号时应重试。2.4.1.2制备各种培养基时，可用2mol/L盐酸或2mol/L氢氧化钠溶液适量调节pH值，使灭菌后的pH值在规定范围内。2.4.1.3几种培养基配方及操作步骤应符合附录A规定。2.4.2培养基要求
2.4.2.1在使用前，细菌培养基须经30~35℃培养48h，霉菌培养基经20~25℃培养国家技术监督局1993-03-16批准1993-11-01实施
72h，证明无菌方可使用。
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2.4.2.2制备好的需气菌、厌气菌培养基4℃保存，15d内用完，管内厌氧区小于液面高度的三分之一不得使用。其他培养基30d内用完2.4.3培养基质量检查
2.4.3.1需气菌、厌气菌培养基经接种每1mL含100个以下的藤黄八叠球菌（28001)菌液1mL，置30~~35℃培养24h后，应生长良好。2.4.3.2 需气菌、厌气菌培养基经接种每 1 mL含 50-个以下的生孢梭菌(64 941)菌液1mL，置30～35℃培养24h后，应生长良好。2. 4. 3. 3 菌培养基经接种每 1 mL含 50个以下的自色念珠菌菌液 1 mL,置 20~～25℃培养24h后，应生长良好。
2.5试验前准备
2.5.1器具灭菌
与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内121℃30min，或置电热干燥箱内160℃2h。
2.5.2无菌室无菌程度要求
无菌室在消毒处理完毕后，应检查空气中的菌落数，方法如下：取内径90mm双碟，无菌操作注人融化的普通肉汤琼脂培养基20mL，制成平板，先在30～35℃培养48h证明无菌后，取双碟平板3只，在无菌室内以平均位置，打开碟盖，在空气中暴露30min后盖好，置30～35℃培养48h后取出检查，3只双碟上生长的菌落数平均不得超过3个，单只碟内菌落不得超过4个。
无菌试验过程中也需检查无菌室的无菌程度，方法同上。在试验开始进行时，打开碟盖在空气中暴露，至试验结束盖好照上法培养，应符合上述要求。2.6对照菌液制备
金黄色葡萄球菌（staphylococcusaureus）菌液：取金黄色葡萄球菌（26003）的普通琼脂斜面新鲜培养物，接种白金耳至需气菌、厌气菌培养基内，在30~35℃培养16～18h后，用无菌0.9%氯化钠注射液稀释成110°即得。2.7试验方法
2.7.1供试品数量
同-一批号至少3个单位供试品。2.7.2浸提介质
0.9%无菌氯化钠注射液
2.7.3供试液制备及接种
2.7.3.1供试液制备及接种应按无菌操作法进行。2.7.3.2管类器具：按管内表面积每10cm2流过管内腔1mL浸提介质，流量为10 mL/mina
2.7.3.3容器类器具：容器内已装有液体的可直接抽取容器内液体为供试液，如未装液体则按容器内表面积每10cm2加人浸提介质1mL，振摇数次。2.7.3.4小型配件或实体类器具：小型配件或实体类器具可直接投放人培养基内：大型实176
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体类器具按表面积每10cm2加人浸提介质1mL,振摇数次。2.7.3. 5供试液应在制备后 2 h 内使用。2.7.3.6每批供试液分别接种于需气菌、厌气菌培养基5管，其中1管接种金黄色葡萄球菌菌液1mL，供作阳性对照。另接种于霉菌培养基2管。供试液的每管接种量与培养基的分装量按表1规定。
供试液总量
>2～20
每管接种量
培养基分装量
2.7.3.7接种后，需气菌、厌气菌培养基在30～35℃培养5d，菌培养基在20～25℃培养7 d。
结果判定
当阳性对照管显混浊并确定有细菌生长时(应在接种后24 h 有细菌生长),可根据观察所得的结果判定。
2.7.4.1如需气菌、厌气菌及霉菌培养管均为澄清或虽显混独但经证明并非有菌生长，均应判为供试品合格。
2.7.4.2如需气菌、厌气菌及霉菌培养管中任何一管显混浊并确证为有菌生长，应重新取样依法复试两次。除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。2.7.4.3如在加人供试液后，培养基出现混浊或沉淀，经培养不能从外观上判断时，可取该培养液转种人另一支相同的培养基中或斜面培养基上，培养48～72h后，观察是否再现混浊或在斜面上有无菌生长，并在转种的同时，取少量培养液，涂片制成染色标本，用显微镜观察是否有菌生长。
3热原试验
3.1定义
本法系将一定剂量的供试液，静脉注人家兔体内，在规定的时间内，观察家兔体温升高的情况，以决定供试品中所含热原的限度是否符合规定的一种方法。3.2主要设备及用具
超净工作台、电热干燥箱、压力蒸汽灭菌器、兔固定器、肛门体温计。3.3试剂
0.9%氯化钠注射液。
3.4供试用家兔
3.4.1—般要求
供试用家兔应健康无伤，毛色光滑，肛门正常，体重1.7~3.0kg，雌雄皆可，雌兔应无孕。测温前7d应用同饲料饲养，在此期间，体重应不减轻，精神、食欲、排泄等不得有异常177
现象。
3.4.2供试用家免的挑选
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3.4.2.1未经使用于热原检查的新免，应在试验前7d内预测体温，进行挑选。挑选试验的条件与检查供试品相同，但不注射药液，每隔1h测量体温1次，共测4次，体温均在38.0～39.6℃的范围内，且最高最低体温的差数不超过0.4℃为符合规定，方可供试验用。3.4.2.2已用于热原检查的家兔，如供试品判定为符合规定，至少应休息48h，方可供第二次检查用。其中升温述0.6℃的家免，应休息两周以上，再按新兔一样测量体温，合格后方可继续供试验用；如供试品判定为不符合规定，且其组内家免平均升温达0.8℃或更大时，则组内全部家免不再使用；两次升温或降温超过合格范围的家兔亦不再使用。3.4.2.3两次使用的间隔时间如超过3周时，应按新免一样测量体温。3.4.2.4每一家兔的使用次数不应超过10次。3.5试验前准备
3.5.1器具灭菌与除热原
与供试液接触的所有器具置电热干燥箱内，180℃干烤2h或250℃干烤30min。3.5.2肛门体温计检定
肛门体温计应经法定计量检定，并在检定周期内使用。注：肛门体温计的精度：39℃以上允差士0.15℃，39℃以下允差士0.1℃。检定周期为一年。3.6试验方法
3.6.1供试品数量
同一批号至少3个单位供试品。
3.6.2浸提介质
0.9%无菌无热原氯化钠注射液。3.6.3供试液制备
3.6.3.1供试液制备应按无菌操作法进行。3.6.3.2管类器具：按管内表面积每3cm2流过管内腔1mL浸提介质，流量为10 mL/min。
3.6.3.3容器类器具：容器内已装有液体可直接抽取容器内液体为供试液；如未装液体则按容器内表面积每3cm2加人浸提介质1mL，振摇5次，已灭菌供试品置37℃2h，未灭菌供试品置60℃2h。
3.6.3.4小型配件或实体类器具：将供试品放人一无菌、无热原具塞器血内，按供试品表面积每3cm2加人浸提介质1mL，振摇数分钟，使供试品完全浸没为止，已灭菌供试品置37℃2h，未灭菌供试品置60℃2h。
3.6.3.5未灭菌供试品浸提液使用前应置压力蒸汽灭菌器内115℃灭菌30min。3.6.3.6供试液应在制备后2h内使用。3.6.4试验用家免准备
3.6.4.1试验用家免数量：一批供试品用免初试3只，复试5只。3.6.4.2预测体温：试验前2h停止喂食到试验完毕。禁食2h后，预测体温两次，间隔时间30～60min，两次体温之差不超过0.2℃，以两次体温的平均值作为该兔的正常体温。当178
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日使用的家免体温应在38.0~~39.6℃的范围内，同一批供试品使用的家免，各兔间正常体温之差不得超过 1℃。
3.6.4.3测温方法：家免装在固定器内，应防止骚动，30mi后开始第一次测温。将肛门体温计或测温探头缓缓插入兔肛门，深度为6cm，测温时间每免至少2min。测温时如兔骚动，应待其安静10 min后再测温。3.6.5供试液注射及注射后测温
3.6.5.1在测定家免正常体温符合要求后15min内，自兔耳静脉缓缓注人温热至38℃的供试液，注射剂量为10mL/kg。
3.6.5.2注射完毕每隔1h测量体温1次，共测3次，以3次体温中最高的1次减去正常体温，即为该兔体温的升高度数。3.6.6家兔降温的处理
降温小于或等于0.4℃视为兔体温正常波动的范围，以“0”计。降温值大于或等于0.6℃应重试。降温值大手0.4℃至小手于0.6℃之间，若3只兔中仅有1只在此范围内以“0”计，若3只兔中有2只或2只以上在此范围内应重试。3.6.7注意事项
3.6.7.1热原试验室内外均应保持安静，避免强烈直射的日光或灯光及其他刺激。3.6.7.2在试验全过程中，避免家兔骚动，保持体温稳定。3.6.7.3在试验前1～2d，供试用家兔应处于同一温度环境中，试验室和饲养室的温度差不得大于5℃，试验室温度为17~28℃。在一次试验全过程中，室温变化不大于5℃，并注意相对湿度保持稳定。
3.6.7.4复试时应取试验次数较少的家兔。3.6.7.5试验过程中，家兔因肛门出血多造成升温或降温超过规定时应重试。3.6.7.6在试验全过程中，不得随意更换肛门体温计。3.6.8结果判定
3.6.8.1在初试3只家免中，体温升高均在0.6℃以下，并且3只家免体温升高总数在1.4℃以下时；或在复试5只家兔中升温0.6℃或0.6℃以上的兔数不超过1只，并且初试复试合并8只家兔的升温总数不超过3.5℃时，均应认为供试品符合热原检查规定。3.6.8.2初试3只家免中，若有1只家兔升温0.6℃或0.6℃以上或3只兔升温均低于0.6℃，但升温总数达1.4℃或1.4℃以上时，应另取5只免复试，检查方法同上。3.6.8.3初试3只兔升温0.6℃或0.6℃以上兔数超过1只时，或在复试5只免中升温0.6℃或0.6℃以上兔数超过1只，或在初试复试合并8只免升温总数超过3.5℃时，均应认为供试品不符合热原检查规定。4细菌内毒素试验
4.1定义及适用范围
本法系列用鲨试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中内毒素限量是否符合规定的一种方法。用以代替家兔法对供试品进行热原初试。本法仅适用于一次性使用输液器、输血器。其他产品可参照使用。179
4.2主要设备
GB/T 14233.2—93
超净工作台、电热干燥箱、恒温水浴。4.3试剂
4.3.1细菌内毒素国家标准品：用于仲裁鲨试剂灵敏度和试验中阳性对照。4.3.2细菌内毒素工作标准品：用于标定鲨试剂灵敏度和试验中阳性对照。4.3.3鲨试剂：灵敏度伪0.25EU/mL，规格为0.5mL。4.3.4无热原水：内毒素含量小于0.05EU/mL。4.4试验前准备
4.4.1器具除热原
与试验液接触的所有器具均应除热原。玻璃器具置电热干燥箱内180℃干烤2h，或250℃干烤30min；塑料器具置30%双氧水中浸泡4h，再用无热原水冲洗后于60℃烘干备用。
4.4.2鲨试剂灵敏度测定
试验前应核对使用批号鲨试剂的灵敏度，应符合规定，4.4.2. 1
4.4.2.2灵敏度测定：根据标示的灵敏度范围，将细菌内毒素工作标准品用无热原水以1-2等比稀释，选择能出现阳性和阴性结果的4个连续稀释液。取同一批号鲨试剂若干支，分别按标示量加人无热原水溶解为鲨试剂溶解液。取10mm×75mm试管若干支，分别加人0.1mL鲨试剂溶解液，加人内毒素稀释液0.1mL,每稀释液平行操作4管，轻轻振动试管混内容物，封闭管口，置37士1℃恒温水浴中保温60士2min观察结果。最高浓度的4管应均为阳性，最低浓度的4管应均为阴性。按式(1)计算标准差：/Eα2 _(Er)2
式中· s～
标准差；www.bzxz.net
α--4个连续内毒素稀释液最低阳性结果浓度的对数值。当s<0.365时，按式(2)计算本批鲨试剂灵敏度（a）：α= log1(）
当s≥0.365时，测定无效。
4.5试验方法
4.5.1供试品数量
同一批号至少3个单位供试品。
4.5.2浸提介质
无热原水。
4.5.3供试液制备
在无菌条件下，每套输液器内腔注人10mL，输血器内腔注人15mL浸提介质，反复荡洗5次后两端密封，置37土1℃恒温箱中保温2h，取出后将供试液汇集至一无菌无热原具塞玻璃容器内。供试液贮存应不超过2h。180
4.5.4试验步骤
GB/T 14233.2—93
将鲨试剂和细菌内毒素工作标准品分别按标示量加大无热原水溶解。细菌内毒素工作标准品逐次稀释至0.5EU/mL，供作阳性对照。取10mm×75mm试管6.支，其中供试品管2支各加人0.1mI供试液，阴性对照管2支各加人0.1mL无热原水，阳性对照管2支各加入0.1mL内毒素工作标准品稀释液，再逐一加入0.1mL鲨试剂溶解液。轻轻混匀试管内容物，封闭管口，垂直放入37士1℃水浴中保温60士2min，轻轻取出，观察结果。4.5.5结果判定
4.5.5.1将试管缓慢倒转180°，管内容物呈坚实凝胶者为阳性，记录为（十），不呈凝胶状或虽呈凝胶状但不能保持完整者为阴性，记录为（一）。4.5.5.2供试品2管均为（-）性时，判定产品符合本法规定，不再进行热原试验4.5.5.3供试品2管均为（+)或有1管为（+）时，用无热原水将供试液1→2等比稀释按上述方法重试，供试品操作4管。如4管均为（一），判定产品符合本法规定，不再进行热原试验。
4.5.5.4重试供试品4管中有1管为（十）时，判定产品不符合本法规定，应进行热原试验，并根据试验结果判定。
4.5.5.5供试品细菌内毒素限量应不超过0.5EU/mL。4.5.5.6阳性对照2管应均为（十），阴性对照2管应均为（一），否则试验无效。5急性全身毒性试验
5.1定义
本法系将一定剂量的供试液由静脉注人小白鼠体内，在规定时间内观察小白鼠有无毒性反应和死亡情况，以决定供试品是否符合规定的一种方法。5.2主要设备及试剂
压力蒸汽灭菌器、动物天平、0.9%氯化钠注射液。5.3试验前准备
5.3.1器具灭菌
与供试液接触的所有器具置压力蒸汽灭菌器内115℃30min。5.3.2试验动物准备
5.3.2.1试验用小白鼠应健康无伤，毛色光滑，眼睛红亮活泼。须在同一饲养条件下饲养，同一来源，同品种，雌者无孕，体重17～23g。做过本试验的小白鼠不得重复使用。5.3.2.2将小白鼠随机分为试验和对照两组，每组5只。复试时每组取18~~19g的小白鼠10只。
5.4试验方法
5.4.1供试品数量
每批供试品至少2个单位供试品。5.4.2浸提介质
0.9%无菌无热原氯化钠注射液。5.4.3空白对照液
GB/T 14233.2--93
0.9%无菌无热原氯化钠注射液。5.4.4供试液制备
5.4.4.1供试液制备应按无菌操作法进行。5.4.4.2管类器具：管内腔注人浸提介质至最大容液量，两端封闭，置60℃8h。5.4.4.3容器类器具：容器内注人浸提介质至公称容量，置60℃8h。5.4.4.4小型配件或实体类器具：供试品放人一无菌具塞器血内，按供试品表面积每3cm2加人浸提介质1mL，振摇数分钟，使其浸没为止，置60℃8h。5.4.4.5未灭菌供试品浸提液使用前应置压力蒸汽灭菌器内115℃灭菌30min。5.4.4.6供试液应在制备后24h内使用。5.4.5供试液注射及注射后动物反应观察指标5.4.5.1将小白鼠放人固定器内，自尾静脉分别注入供试液和空白对照液，注射速度为0.1mL/s，注射剂量为50mL/kg。5.4.5.2注射完毕后，观察小白鼠即时反应，并于4、24、48和72h观察和记录试验组和对照组动物的一般状态,毒性表现和死亡动物数。5.4.5.3注射动物反应观察指标按表2规定。表2
5.4.6注意事项
未见毒性症状
轻度症状但无运动减少，呼吸困难或腹部刺激症腹部刺激症状，呼吸困难，运动减少，眼脸下垂，腹泻衰竭，发，髋颤，严重腹部刺激症状，眼脸下垂，呼吸困难注射后死亡
5.4.6.1注射完毕如发现有血或供试液外溢现象，此小白鼠应弃去，另取小白鼠依法操作。5.4.6.2试验后待观察小白鼠喂养方法同试验前。5.4.6.3试验用小白鼠盒内数量不宜过多，避免照成发热，出汗影响试验结果。5.4.6.4实验室与饲养室室温控制在19~28℃。5.4.7结果判定
5.4.7.1在72h观察期内，试验组动物的反应不大于对照组动物，则判定供试品合格。5. 4. 7. 2
如试验组动物有2只以上出现中度毒性症状或死亡，则判定供试品不合格。5.4.7.3如试验组动物有2只以上出现轻度毒性症状，或不超过1只动物出现中度毒性症状或死亡，则另取体重18～~19g小白鼠10只为1组进行复试，复试结果符合5.4.7.1条要求，判定供试品合格。
溶血试验
6.1定义
本试验是通过供试品与血液直接接触，测定红细胞释放的血红蛋白量以检测供试品体182
外溶血程度的一种方法。
6.2主要设备
GB/T 14233. 2---93
恒温水浴、分光光度计、离心机6.3试剂
2%草酸钾溶液、0.9%氯化钠注射液。6.4试验方法
6.4.1供试品数量
同一批号至少2个单位供试品。
6.4.2漫提介质
0.9%氟化钠注射液。
6.4.3供试品制备
称取供试品15g，管类器具切成0.5cm长小段，其他类型器具切成0.5cm×2cm条状或块状。
6.4.4新鲜稀释抗凝兔血制备
6.4.4.1由健康家兔心脏采血20mL，加2%草酸钾1mL,制备成新鲜抗凝兔血。6.4.4.2取新鲜抗凝兔血8mL，加0.9%氯化钠注射液10mL稀释。6.4.5试验步骤
6.4.5.1供试品组3支试管，每管加人供试品5g及0.9%氯化钠注射液10mL；阴性对照组3支试管，每管加人0.9%氯化钠注射液10mL，阳性对照组3支试管，每管加人蒸馏水10mL。
6.4.5.2全部试管放人恒温水浴中37℃保温30min后，每支试管加入0.2mL稀释兔血，轻轻混匀，置37℃水浴中继续保温60min。6.4.5.3倒出管内液体离心5min（2500rpm）。6.4.5.4吸取上清液移人比色血内，用分光光度计在545nm波长处测定吸光度。6.4.6结果计算
供试品组和对照组吸光度均取3支管的平均值。阴性对照管的吸光度应不大于6. 4. 6. 1
0.03；阳性对照管的吸光度应为0.8士0.3。6.4.6.2溶血率按式(3)计算：
式中：A—供试品组吸光度；
溶血率（%）=
B——阴性对照组吸光度;
C阳性对照组吸光度。
6.4.7结果判定
溶血率小于5%判定供试品合格。-B×100
....(3)
7细胞毒性试验
7.1定义　
GB/T14233.2--93
第二篇材料试验
本试验是将定量的供试液加人细胞培养液中，培养L929细胞，通过对L-929细胞生长和增殖影响的观察，评价供试品对细胞的潜在毒性作用。7.2主要设备及用具
超净工作台、电热恒温培养箱、冰箱、倒置显微镜、光学显微镜、压力蒸汽灭菌器、液氮瓶、培养瓶。
7.3试剂
乙醇、苯酚、台盼蓝、小牛血清、青霉素 G(钠盐)硫酸链霉素、乙二胺四乙酸二钠(EDTA）、胰酶、Earle 液、Hanks 液、D-Hanks 液、Eagie培养液、细胞培养液、细胞消化液。7.4几种平衡盐溶液(BSS)和细胞培养液、消化液配制应符合附录 B规定。7.5细胞株
推荐使用L-929细胞（小鼠成纤维细胞）。试验采用L-929传代48～72h生长旺盛的细胞。
7.6器具灭菌
与供试液接触的所有器具置压力蒸汽灭菌器内121℃灭菌30min。7.7试验方法
7.7.1供试液制备
7.7.1.1将供试品薄片用肥皂水清洗除去油污，再用重蒸馏水冲洗干净，滤纸吸干后切成0.5cm×2cm条状，用压力蒸汽灭菌或紫外线照射消毒。7.7.1.2将供试品放人--无菌培养瓶内，按供试品表面积每1cm2加入细胞培养液10mL，封闭瓶口置37℃24h。
7.7.2细胞培养
7.7.2.1细胞培养应按无菌操作法进行。7.7.2.2细胞悬液制备：将已培养48~~72h生长旺盛的L-929细胞用消化液消化5~10min,Hanks液洗涤2～3次，加人细胞培养液，用吸管把细胞从瓶壁上吹打下来。混匀后取0.9mL加0.4%台盼蓝溶液0.1mL，混合。4min后用血球计数板在显微镜下计数，按式（4)计算出细胞浓度（单位为细胞数/mL原液）：中央和四角5大格内细胞总数×10 0005
根据实测细胞浓度，将适量细胞培养液加入培养瓶，配制成40000/mL的细胞悬液备用。
7.7.2.3取培养瓶33只，分别加人细胞培养液4mL，细胞悬液1mL，置37℃培养24h。7.7.2.4培养24h后弃去原培养液。阴性对照组13只培养瓶（其中1只备用）加入新鲜184
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的Eagle细胞培养液；阳性对照组10只培养瓶（1只备用）加人含6.3%苯酚的细胞培养液；供试品组10只培养瓶(1只备用)加人含50%供试液的细胞培养液。置37℃继续培养。7.7.3细胞形态学观察和计数
7.7.3.1在更换培养液的当天，取阴性对照组3瓶，并在更换后第2、4、7d，每组各取3瓶进行细胞形态学观察和细胞计数。7.7.3.2细胞形态用倒置显微镜观察，并摄影对比。7.7.3.3加人适量消化液消化，然后制成细胞悬液，用血球计数板在显微镜下计数，并按式(4)计算细胞浓度。
7.7.4毒性评定
细胞形态分析标准按表3规定：
7.7. 4. 1
轻微毒
中等毒
严重毒
细胞形态正常，贴壁生长良好，L-929 细胞皇棱形或不规则兰角形细胞贴壁生长好，但可见少数细胞圆缩，偶见悬浮死细胞细胞贴壁生长不佳，细胞圆缩较多，达1/3以上，见恶浮死细胞细胞基本不贴壁，90%以上呈悬浮死细胞7.7.4.2根据各组细胞浓度按式(5)计算细胞相对增殖度(RGR)：供试品组(或阳性对照组）细胞浓度平均值× 100%RGR
阴性对照组细胞浓度平均值
7.7.4.3细胞相对增殖度分级标准按表4规定：表4
7.7.5结果评价
7.7.5.1相对增殖度供试品组为0或1级判为合格。相对增殖度
7.7.5.2相对增殖度供试品组为2级，应结合形态分析，综合评价。7.7.5.3相对增殖度供试品组为3~5级判为不合格。皮内刺激试验
+++*++*+(5)
8.1定义
本试验系将一定量的供试液注入家兔皮内，通过对其局部皮肤反应的观察，评价供试品185
对接触组织的潜在刺激性。
8.2主要设备及用具
GB/T 14233.2--93
压力蒸汽灭菌器、兔固定器、皮内注射器。8.3试剂
75%乙醇、0.9%氮化钠注射液。
8.4实验动物准备
8.4.1健康新西兰兔，体重2.0～2.5kg，无任何皮肤疾病或损伤，未做过任何试验。8.4.2初试用兔2只，复试用免3只。8.4.3试验前24h在免脊柱两侧各剪剃5cm×15cm区域兔毛，应避免损伤皮肤。8.5试验方法
8.5.1浸提介质
0.9%氯化钠注射液。
8.5.2空白对照液
0.9%氯化钠注射液
8.5.3供试液制备
供试品预处理同7.7.1.1条，切成0.5cm×2cm条，放人一玻璃器Ⅲ内，按其表面积每3cm2加人浸提介质1mL，封闭后置压力蒸汽灭菌器内121℃浸提1h，即得供试品浸提液。不加供试品，同条件制备空白对照液。8.5.4注射方法
用75%乙醇清洁暴露皮肤，在免脊柱一侧选择10个点，每点间隔2cm，各点注射0.2mL供试品浸提液；脊柱另一侧选择5个点，每点间隔2cm，各点注射0.2mL空白对照液。8.5.5结果观察
8.5.5.1注射后24h、48h和72h观察注射局部及其周围皮肤组织反应，包括红斑、水肿和坏死等。
8.5.5.2皮肤反应记分标准按表5规定。表5
无红斑现象
轻度红斑(勉强可见）
明显红斑(淡红色）
中度红斑(鲜红色)
重度红斑（紫红色伴有轻微焦痴形成）8.5.6结果评价
无水肿现象
轻度水肿(勉强可见皮肤增厚)
明显水肿(隆起而轮廊清楚）
中度水肿(隆起近 1 mm)
重度水肿(隆起大于 1 mm)
8.5.6.1试验侧皮肤反应不超过对照侧皮肤反应，则表明供试液对皮肤无刺激作用。8.5.6.2试验侧皮肤反应有2处以上明显超过对照侧反应，则表明供试液对皮肤有刺激作用。
试验侧仅有1处呈明显或严重反应时，则应另选3只免进行复试。复试试验侧与8.5.6.3
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