【商检行业标准(SN)】 鸡马立克氏病病毒分离与鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T 1454—2004

鸡马立克氏病病毒分离与鉴定方法

Isolation and identification for Marek's disease virus of chicken

2004-06-01 发布 2004-12-01 实施

中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局 发布

前 言

本标准的附录A、附录B均为规范性附录。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准由中华人民共和国陕西出入境检验检疫局和山东出入境检验检疫局负责起草。

本标准主要起草人：陈茂盛、管恩平、马玉玲、寇改霞。

本标准为首次发布的出入境检验检疫行业标准。

鸡马立克氏病病毒分离与鉴定方法

1 范围

本标准规定了鸡马立克氏病病毒(MDV)的分离鉴定方法。

本标准适用于鸡马立克氏病(MD)流行病学调查和口岸检疫。

2 材料准备

1. 2.1 一龄SPF敏感鸡：用SPF种蛋孵化。
2. 2.2 鸭胚成纤维细胞(DEF)的制备，见附录A。
3. 2.3 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备：同2.2。
4. 2.4 细胞培养液的制备，见附录B。
5. 2.5 淋巴细胞分离液。
6. 2.6 标准的MDV分型单克隆抗体。
7. 2.7 缓冲溶液配制：
   • 磷酸盐缓冲液(PBS)；
   • 含0.05%吐温-20的PBS。
   以上溶液配制方法见附录D。
8. 2.8 标准MDV：MDV I型病毒GA毒株。

3 采样

挑选临床发病的MD疑似病鸡，无菌采集枸橼酸钠抗凝血5 mL/鸡～10 mL/鸡，加入淋巴细胞分离液，200 g离心5 min，分离收集淋巴层细胞，并用无菌PBS洗涤两次，用细胞维持液稀释成$10^7$个/mL。将淋巴细胞悬液直接进行鉴定或者加入3.5%的二甲基亚砜后保存在液氮(-196℃)中备用。

4 操作方法

1. 4.1 接种和培养

   取生长良好的DEF单层，弃去维持液，接种0.2 mL处理好的淋巴细胞悬液，置含5%二氧化碳的培养箱，37℃下吸附1.5 h。补充适量维持液继续培养，24 h内换液一次，以后每2 d～3 d换液一次。在培养过程中每日观察细胞病变(CPE)产生情况，同时设立不接种样品的空白细胞对照组。

2. 4.2 收集

   在空白细胞对照组的细胞生长良好的情况下，将产生广泛CPE(使其形成面积占30%以上)的DEF单层培养瓶中的维持液弃去，用0.01%胰酶消化，加细胞生长液制成细胞悬液直接供鉴定用，或者加入二甲基亚砜后置液氮(-196℃)中保存备用。

3. 4.3 克隆

   将收集到的具有广泛CPE的细胞悬液进行稀释，接种于96孔细胞培养板，使每孔平均含有1个细胞。继续培养至孔内产生CPE。选择只有单个灶状的孔，吹打下贴壁细胞，移入细胞培养瓶扩大培养。同法重复克隆二至三次。所收集的培养物就是供鉴定用的MDV分离物。