【商检行业标准(SN)】 锦鲤疱疹病毒分离和聚合酶链反应试验操作规程

SN

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T 1674—2005

锦鲤疱疹病毒分离和聚合酶链反应
试验操作规程

Protocol of viral isolation and polymerase chain reaction
for koi herpesvirus

2005-09-30发布 2006-05-01实施

前 言

本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：刘燕、高晓英、史秀杰、何俊强、杨锦平、江育林。

本标准为首次发布的出入境检验检疫行业标准。

锦鲤疱疹病毒分离和聚合酶链反应
试验操作规程

1 范围

本标准规定了锦鲤疱疹病毒(KHV)分离和聚合酶链反应(PCR)检测方法。

本标准适用于锦鲤疱疹病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T 6682—1992 分析实验室用水规格和试验方法 (eqv ISO 3696:1987)

GB/T 18088—2000 出入境动物检疫采样

3 试剂和材料

3.1 水：符合 GB/T 6682—1992 中一级水的规格。

3.2 KHV 病毒参考株：由国家质量监督检验检疫总局指定的实验室提供。

3.3 锦鲤终条细胞(KF)：用 Eagle's 培养液(见附录 A.5 章)培养于 25℃。

3.4 Taq 酶：-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。

3.5 dNTP：含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 10 mmol/L。

3.6 引物：浓度为 40 μmol/L。其序列如下：

KHV9/5F, 5'- GAC AAC GCC GGA AAC CTT GTG 3'

KHV9/5R, 5'- CAC AAG TTC AGT CTG TTC CTC AA-3'

3.7 异丙醇：分析纯，使用前须冷却到 -20℃。

3.8 矿物油：要求无 DNA 酶和 RNA 酶。用于热盖的 PCR 扩增仪。

3.9 分子量标准：推荐使用 pUC19 DNA/MspI (Hpa II)，各片段大小依次为 501, 404, 335, 242, 190、147 bp。

3.10 HEPES。

4 器材和设备

4.1 96 孔细胞培养板。

4.2 倒置显微镜。

4.3 恒温培养箱。

4.4 普通冰箱和超低温冰箱。

4.5 组织研磨器。

4.6 离心机和离心管。

4.7 PCR 扩增仪。

4.8 水平电泳仪。

4.9 微量移液器及吸头。