【商检行业标准(SN)】 水泡性口炎逆转录聚合酶链反应操作规程

SN

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T 1166.3—2006

水泡性口炎逆转录聚合酶链反应操作规程

Protocol of reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)
for vesicular stomatitis virus

2006-01-26 发布 2006-08-16 实施

中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局

前 言

SN/T 1166分为三部分：

• ——水疱性口炎补体结合试验操作规程；
• 水疱性口炎微管血清中和试验操作规程；
• ——水疱性口炎逆转录聚合酶链反应操作规程。

本部分为SN/T 1166的第3部分。

本部分的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。

本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本部分起草单位：中华人民共和国云南出入境检验检疫局。

本部分主要起草人：花群义、周晓黎、徐自忠、董俊、汤云庆、龙志保。

本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。

水泡性口炎逆转录聚合酶链反应操作规程

1 范围

SN/T 1166的本部分规定了水泡性口炎病毒新泽西型(NJ)和印第安那型(IND)的RT-PCR定性和定量检测方法。

本部分适用于水泡性口炎病毒的鉴定及本病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过SN/T 1166的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。

GB/T 5682 分析实验室用水规格和试验方法

3 试剂和材料

3.1 水

应符合GB/T 5682中一级水的规格。

3.2 试剂纯度

所有的化学试剂均为分析纯。

3.3 水泡性口炎病毒标准株

新泽西型(NJ)和印第安那型(IND)标准病毒株，由指定单位提供。

3.4 Taq酶

-20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。

3.5 逆转录酶AMV

-20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。

3.6 RNA抑制剂(RNasin)

20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。

3.7 dNTP

含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10 mmol/L。

3.8 引物

3.8.1 该试验用水泡性口炎病毒L蛋白基因较保守的序列为PCR扩增区。采用半套式RT-PCR方法，半套式引物分别根据NJ株和IND株扩增区的碱基差别设计。

外侧引物I (P1): 5' AAG GCT CTC TGT TTC CGG ATC TGG 3'

外侧引物II (P2): 5' TGA TTC AAT ATA ATT ATT TTG GGA C 3'

NJ半套式引物(P3): 5' TGT TCT GGT GTG CAA ACC AGG TAT C 3'

IND半套式引物(P4): 5' AGT AGA ACT GTG CAA GCC CGG TAT C 3'

3.8.2 用DEPC水将引物配制成浓度为25 pmol/μL。

3.9 异戊醇

使用前须冷到-20℃。