【YY医药标准】 ISO 17853 :2011 植入物材料的磨损聚合物和金属材料磨屑分离和表征

ICS11.040.40
中华人民共和国医药行业标准
YY/T0652—2016/IS017853.2011代替YY/T0652—2008
植入物材料的磨损
聚合物和金属材料磨屑
分离和表征
Wear of implant materials-
Polymer and metal wear particles-Isolation and characterization（ISO17853:2011,IDT）
2016-01-26发布
国家食品药品监督管理总局
2017-01-01实施
术语和定义
原理、试剂和仪器
组织样本中聚合物磨屑和金属磨屑的取样和分析方法5关节模拟器润滑液中聚合物和金属磨屑的取样和分析方法试验报告
参考文献
YY/T0652—2016/IS017853:201113
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。YY/T0652—2016/ISO17853:2011本标准代替YY/T0652--2008《植人物材料的磨损员聚合物和金属材料磨屑
分离、表征和定量
分析方法》，与YY/T0652一2008相比，主要技术变化如下：增加了5.4陶瓷磨屑的处理步骤；删除了原标准中3.9对照试验和3.10颗粒数计算。
本标准使用翻译法等同采用IS017853：2011《植人物材料的磨损聚合物和金属材料磨屑分离和表征》。为了便于使用，本标准做了下列编辑性修改：将标准市的浓度单位M用mol/L代替，M不属于GB3101和GB3102客部分所给出的单位。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家食品药品监督管理总局提出。本标准由全国外科植人物和矫形器械标准化技术委员会材料及骨科植人物分技术委员会(SAC/TC110/SC1)归口。
本标准起草单位：天津市医疗器械质量监督检验中心、中国食品药品检定研究院、国家食品药品监督管理局医疗器械技术审评中心，中国矿业大学。本标准主要起草人：张晨、安俊波、宋铎、刘丽、王硕、汤京龙、王春仁、郭晓磊、孙嘉怪、刘洪涛、张德坤。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为YY/T0652—2008.wwW.bzxz.Net
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YY/T0652—2016/ISO17853：2011引言
磨屑的生物反应可导致骨吸收和假体松动，从而导致关节植人物失效。如要对磨屑进行表征，就必须有一个从组织中提取磨屑的统一方法，以确保对磨屑影响的评价有一个统一标准。对植入物模拟器产生的磨屑表征还为正在研究中的植入物的磨损性能和使用性能提供了有价值的信息。本标准中，对组织中或模拟器润滑液中的磨屑进行分离和表征的第一种方法是用过滤或嵌人树脂的方法进行磨屑分离，然后使用扫描电子显微镜（SEM)或透射电子显微镜（TEM)对磨屑进行分析。对模拟器中植人物金属磨屑进行分离和表征的另一种方法近期得以发展，磨屑可被沉积在晶片上进行SEM分析，无需过滤或镶嵌。本标准出版时，第二种方法还未用于对组织中的磨屑进行分离和表征，两种方法所得结果没有直接对比。因此，后者没有详细列出。IV
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1范围
植入物材料的磨损
YY/T0652—2016/ISO17853:2011聚合物和金属材料磨屑分离和表征本标准规定了植入人体和模拟器中关节置换植人物所产生的磨屑的取样方法。本标准规定了分离和表征聚合物和金属磨屑（磨屑来源于翻修手术或验户时关节置换植人物周围切除的组织或关节模拟器润滑液)的仪器、试剂和试验方法。其中一些步骤可适用于人体体液中磨屑的分离和表征（例如关节滑液）。
本标准中没有对植人物产生的磨损程度进行量化；也没有规定任何特定表面的磨损量。本标准不包括磨屑的生物反应，也不包括用于评估生物安全性的方法。2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。2.1
聚合物磨屑polymerwearparticle植人物的聚合物部件磨损产生的颗粒。2.2
metal wear particle
金属磨屑
植人物的金属部件磨损产生的颗粒及颗粒状腐蚀产物。2.3
ceramice wear particle
陶瓷磨肩
植人物的陶瓷部件磨损产生的颗粒。3原理、试剂和仪器
3.1原理
聚合物磨屑和金属磨屑通过消化组织样本和模拟器润滑液分离出来，再通过清除其他有机物碎屑提纯得到，
注：分离聚合物磨屑和金属磨屑的方法是不同的，将在4.2和4.3中分别描述。收集磨屑，采用扫描电子显微镜（SEM)或透射电子显微镜（TEM）表征和计数（如适用）。3.2试剂
在分析过程中，除非另有说明，仅采用公认分析等级的试剂、蒸馏水或同等纯度等级的水。为避免外来颗粒污染样品，所有的试剂溶液在使用前应采用0.2um或更小孔径的滤膜进行过滤。3.2.1无水乙醇
3.2.2丙酮
100%或用蒸馏水稀释至80%。
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YY/T0652—2016/ISO17853:20113蒸馏水
牛固定剂
例如福尔马林，用蒸馏水稀释至10%。3.2.5
盐酸溶液，HCI
c=0.0lmol/L。
3.2.6异丙醇-水混合液
p=0.96g/cm及p=0.90g/cm。
3.2.7木瓜蛋白酶溶液
4.8U/1.5mL木瓜蛋白酶，溶于含有25mmol/L乙二胺四乙酸溶液（EDTA）的250mmol/L磷酸钠缓冲液（pH值为7.4）。
3.2.8磷酸钠缓冲液
250mmol/L中含有25mmol/L乙二胺四乙酸溶液（EDTA），pH值为7.4。9蛋白酶K
2g/mL，溶于50mmol/LTRIS-HCl缓冲液中得到，pH值为7.6。注：对于从关节模拟器血清润滑液中分离的磨屑，试剂的加人量需根据分离磨屑的润滑液中血清百分比和最初的血清体积来调整，见5.3.2。
3.2.10树脂
环氧树脂，例如EMbed812。
3.2.11十二烷基硫酸钠(SDS)
溶于蒸馏水时浓度为2.5g/100mL，或者溶于80%丙酮中，浓度为3g/100mL。3.2.12氢氧化钠（NaOH）
NaOH，溶液和颗粒，c=5mol/L。3.2.13蔗糖溶液
p=1.35g/cm1.17g/cm.1.08g/cm.1.04g/cm2和1.02g/cm。3.2.14TRIS-HCI缓冲液
TRIS-HC1缓冲液，50mmol/L.pH为值7.63.3仪器
所有仪器使用之前应清洗，并用蒸馏水（提前用孔径为0.2μm的滤膜过滤）清洗三次，以去除所有污染颗粒。
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3.3.1铝条
精度至少为0.1mg。
碳胶带
离心管
多种尺寸。
离心机
用于过滤试剂和蒸馏水，孔径为0.2μm。3.3.7
过滤装置
镀聚醋酸甲基乙烯脂铜网（formvar铜网）200目网格，用作透射电子显微镜（TEM)分析。3.3.9
傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）加热板
无尘布
移液管、微量吸液管和针头
偏光显微镜
聚碳酸酯膜过滤器
YY/T0652—2016/ISO17853.2011孔径为10μm.1μm.0.1μm.0.05μm及0.015μm，用于收集颗粒。3.3.15
扫描电子显微镜（SEM）
包括能量弥散X射线分析模块（EDXA）。3.3.16
无菌培养血
带盖。
注射器
粗针头。
聚四氟乙烯玻璃陶瓷组织研磨机透射电子显微镜（TEM）
包括能量弥散X射线分析模块（EDXA）。3
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YY/T0652—2016/ISO17853:20113.3.20超声波细胞粉碎机
配备钛微探针。
3.3.21超声波清洗器
3.3.22水浴锅
搅拌温度控制。
4组织样本中聚合物磨屑和金属磨屑的取样和分析方法4.1样本的保存和制备
将组织保存在一70℃（或史低温度）的冰箱中，或在室温下保存于固定剂中，例如福尔马林（3.2.4），福尔马林用蒸馏水（3.2.3）稀释至10%。需要时将组织解冻，在浸提萃取工作之前将试样用蒸馏水清洗干净。将清洗后组织里的多余水分用无尘布吸走。未固定的组织样本应在通用条件下进行处理。如果发生污染现象，用于取出样品的手术器械的特征应记录在案。注：由于样品来源不同，样品之间可能存在差异性，4.2聚合物磨屑的分离步骤
4.2.1组织消化
假体周围组织中聚乙烯磨屑的分离有许多已知方法。这里提到的方法是以Campbell等)，Tipper等3和Richards等山的方法为基础制定的。消化前，用手术刀和刀片将组织切成小片以加速消化。将组织放在体积比为2：1的氯仿和甲醇混合液中24h，直至组织沉到容器底部，以去除切碎的组织中的油脂。取出并用磷酸钠缓冲液（3.2.8）冲洗组织样本。
将5mol/LNaOH溶液（3.2.12)加人到组织样本中(1g组织中加人10mL的5mol/LNaOH溶液），置于65℃的搅拌水浴锅（3.3.22)中消化至少24h。当无可见的固体组织碎片悬浮时可认为消化完成。
4.2.2聚合物磨屑提纯
4.2.2.1总则
可使用多种方法将聚合物磨屑从消化的组织中提纯。使用4.2.2.2或4.2.2.3中描述的方法。4.2.2.2高速离心法提纯聚合物磨屑本方法可收集粒径为纳米级到几毫米的全部磨屑，能够将所有体积的磨屑分离出来。将消化后的组织冷却到4℃，加人同等体积冷冻的无水乙醇（3.2.1）。这时可能有盐分沉淀。如果出现这种情况，加人超纯水直至盐分溶解。将溶液放置在4℃环境中，并搅拌过夜。将溶液在4℃，20000g离心力作用下离心2h。将上清液移人清洁的无菌管（3.3.4），在过滤前用400mL超纯水稀释。4.2.2.3超速离心法提纯聚合物磨屑将薰糖溶液（3.2.13)(p=1.35g/cm2，1.17g/cm21.08g/cm21.04g/cm2和1.02g/cm）各2mL4
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YY/T0652—2016/ISO17853:2011分别加人离心管（3.3.4)中，加人量约为离心管容量的四分之三，然后将已消化的组织悬浮液按量等分，注人每个离心管蔗糖溶液表面，在5℃、100000g离心力作用下将其离心3h。谨慎收集离心管上清液，加人无菌管，并用65℃蒸馏水稀释残余的蔗糖。将稀释后的溶液超声波10min，使积聚的磨屑散开，然后在80℃下加热1h，以便溶解蔗糖。将异丙醇-水混合液（3.2.6）（密度分别为0.90g/cm和0.96g/cm2）分别注人各离心管中，形成上下两层液体，取一定量上一步获得的悬浮液加人各离心管中，在20℃、100000g离心力作用下离心1h。将离心管移出离心机后，在两层液体的交界处应看见一层白色磨屑。用细尖玻璃移液管（3.3.12）插入异丙酮层液间，将包含聚乙烯磨屑的微粒层移出至无菌管中，超声波10min以使积聚的磨屑分散开。
如果在不同的超速离心时间和速度下提纯磨屑，只要经证实有相同的分离效果，并且其验证程序的结果已形成文件，也可按照该方法进行分离。注1：第一次超速离心是为了把铰轻的聚乙烯磨屑层从较重的组织碎片中分离出来。第二次超速离心是通过离心形成一个细分密度梯度场，达到纯化聚乙烯磨屑的目的。注2：这个方法可能无法收集到尺寸较大的聚乙烯颗粒产物，使得增损物不能全部分离出来。4.3金属磨屑的分离步骤
由于金属在强酸和强碱中的可溶性，应使用酶消化法。下列方法由Catclas等s提出，与其在早些时候开发出的分离关节模拟器润滑液中磨屑的步骤相似“1（参见第5章），只在开始步骤及使用组织替代血清润滑液导致的所用酶的浓度有些许不同。注1：通过同样步骤分离和表征的组织及关节模拟器磨屑，其结果能够直接而精确地进行对比订，这对于关节模拟器的有效性是很重要的，是该方法的优点。a）用手术刀和刀片将组织切成碎片以加速消化过程。将一些小碎片（大约2mm×2mm×2mm）加人2mL的无菌管中。
注2：组织样本的重量取决于可观察到的病人的全部磨损部位以及用于磨屑分离的组织大小（例如，肉芽肿、囊性变）。
推荐的组织样本湿重为100mg～150mg，但必要时可调整。b）在pH值为7.4的磷酸钠缓冲液（3.2.8)中清洗四次，每次2min。c）将组织碎片放人1mL的十二烷基硫酸钠（3.2.11)（2.5g溶解于100mL蒸馏水中）中煮沸10min。当沸腾后，使用聚四氟乙烯-玻璃陶瓷组织研磨机（3.3.18）研磨组织，使其均匀分散到溶液中，每2min一次。
d）室温下冷却10min。
e）放人离心管，在16000g离心力作用下离心10min。用经蒸馏水稀释至体积分数为80%的丙酮（3.2.2）清洗一次，在16000g离心力作用下离心f）
10 min。
用1mLpH值为7.4的含有25mmol/L乙二胺四乙酸的250mmol/L磷酸钠缓冲液清洗g
3次，每次清洗后在16000g离心力作用下离心10min。h）用配备微探针的超声波细胞粉碎机对1mLpH为7.4的含有25mmol/L乙二胺四乙酸的250mmol/L磷酸钠缓冲液中超声波20s~25s，或者放在超声波水浴锅中处理30min。使用超声波细胞粉碎机更加高效，但使用时宜配备一个清洁的未破坏/未腐蚀的探针，以避免探针可能带来的钛污架
i）加人0.5mLpH为7.4的含有25mmol/L乙二胺四乙酸的250mmol/L磷酸钠缓冲液和木瓜蛋白酶（3.2.7)（4.8U/1.5mL磷酸钠缓冲液）。在65C的搅拌水浴锅（3.3.22）中培养24h。放人离心管，在16000g离心力作用下离心10min。5
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YY/T0652—2016/IS017853:2011k）用微量移液管谨慎移除上清液，避免触碰管底部的颗粒。将颗粒放人1mL的十二烷基硫酸钠中（2.5g/100mL蒸馏水）。1）
m）煮沸10min。
在室温下冷却10min。
将离心管在16000g离心力作用下离心10min。o）
用微量移液管谨慎移除上清液，避免触碰到管底部的颗粒。p）
用1mL，50mmol/LTRIS-HCI缓冲液（pH=7.6）清洗颗粒，然后在16000g离心力作用下q
离心10min。在不触碰管底部颗粒的情况下，用微量移液管谨慎移除上清液。重复步骤一次。
将颗粒放人1mL50mmol/LTRIS-HCI缓冲液中，用配备有微探针的超声波细胞粉碎机处s
理30s，或者放人超声波水浴锅中处理30min。再次强调，使用超声波细胞粉碎机更加高效，使用时宜配备一个清洁的未破坏/未腐蚀的探针，以避免探针可能带来的钛污染。加人蛋白酶K（3.2.9)(2g/mLTRIS-HCI缓冲液）在55C的搅排水浴锅中培养24h。t)
u）将离心管在16000g离心力作用下离心15min。在不触碰管底部颗粒的情况下用微量移液管谨慎移除上清液。v）
w）将颗粒放人1mL十二烷基硫酸钠中（2.5g/100mL蒸馏水）。煮沸10min。
在室温下冷却10min。
在16000g的离心力作用下离心15min。aa）用微量移液管谨慎移除上清液，避免触碰到管底部的颗粒。bb）用1mL，50mmol/LTRISHCl缓冲液（pH=7.6）清洗颗粒在16000g的离心力作用下离心15min。在不触碰管底部颗粒的情况下，用微量移液管谨慎移除液体。cc）先用0.5mL包含3%十二烷基硫酸钠（3g/100mL)（3.2.11)的体积分数为80%的丙酮溶液进行清洗，然后在16000g下离心15min，在不触碰管底颗粒的情况下，用微量移液管谨慎移除液体。
dd）用1mL蒸馏水清洗，然后在16000g下离心15min，在不触碰管底颗粒的情况下用微量吸液管谨慎移除液体。
ee）添加无水乙醇后，置于4C下保存直至收集颗粒（见4.4.2）。注3：步骤g）到i)可以用50mmol/L的TRISHCI缓冲液进行操作。随后应验证所使用的木瓜蛋白酶的有效性。4.4磨屑的收集
4.4.1聚乙烯磨屑
使用0.1μm孔径的滤膜收集磨屑，然后再用孔径为0.015μm或者相似的滤膜过滤。当磨屑的分离用高速离心法或者需要收集全部磨屑时，可用真空过滤系统过滤4.2.2.2方法获得的全部磨屑。当用超速离心法分离磨屑时（见4.2.2.3），可过滤10μL～300μL的磨屑悬浮液或者更大体积的稀释悬浮液。
注：当悬浮液几乎透明时可认为达到合适的稀释量，通常稀释的比例为1：10～1：100，目的是改变磨屑浓度，分散滤膜上的磨屑以利于SEM观察，确保观测到合适数量的磨屑（至少100个微粒）。稀释时应记录下每个样本准确的稀释数据。过滤时，用注射器（3.3.17）提取已知体积的微粒悬浮液，将注射器的末端连接到过滤装置（3.3.7)上。给注射器柔和加力，将水通过滤膜流出，流速约为每秒一滴水（0.045mL），这样微粒沉积在滤膜表面。如果滤膜堵塞应及时更换。对用过的滤膜按以下步骤处理：用蒸馏水冲洗滤膜和注射器，在用镊子将滤膜从过滤装置中移出前，使用气体冲刷滤膜，冲刷方向6
与过滤方向一致，然后在无菌带盖的培养血中干燥。YY/T0652—2016/ISO17853:2011由于颗粒尺寸很小，如果可以，应使用孔径小于0.1μm的滤膜。在这种情况下，可进行连续过滤以避免滤孔堵塞。
4.4.2金属磨屑
在乙醇中将磨屑以16000g离心力下离心20min（4.3中的分离方案）。移除上清液，然后加人0.5mL纯丙酮和环氧树脂（3.2.10）混合液（1：1）。室温下，将离心管放在管夹上旋转一晚（如果磨屑非常小，可缩短时间）。在16000g离心力作用下将磨屑离心20min，用微量移液管谨慎移除上清液，避免接触离心管底部的磨屑。将离心管放人真空中1h以去除剩余的丙酮。在离心管中加人1mL纯环氧树脂（3.2.10），然后在真空中放置3h。将离心管在60C环境中静置48h，使树脂固化。去除塑料离心管得到固体树脂，磨屑固定在树脂底部。该方法能使树脂渗透在磨屑之间，使颗粒分散开。用金刚石刀具将含有磨屑的树脂切割成片（厚度为100nm～120nm），将切片铺展在200目的镀聚醋酸甲基乙烯脂铜网格上，用透射电子显微镜分析[5]1.6]。切片应保证能代表所有的磨屑（若可能应全部切片）。
注：金属磨屑也可用0.015μm的滤膜在真空过滤器中收集，用高分辨率扫描电子显微镜进行分析。然而使用这种方法时，实验人员必须注意可能存在的微粒积聚和氧化现象，及微粒损失问题。4.5磨屑尺寸和形状表征
4.5.1聚乙烯磨屑
对于磨屑的SEM成像，使用碳胶带（3.3.3)将有磨屑的滤膜粘在SEM样品台上。对滤膜进行喷金或者镀其他导电材料，例如铂或钯，使磨屑具有导电性。镀层的厚度应为3nm～5nm。对聚合物磨屑的成像，加速电压不能超过10keV。表征大于0.1μm的磨屑时，在有磨屑的滤膜上随机选取不重叠区域的100个磨屑，放大至少5000倍进行成像。对于尺寸大于10±m的磨屑，使用较小的放大倍数，例如500倍。如ASTMF1877-059中所述，用一系列预先定义的描述，例如长度、宽度、等量直径（与磨屑相等面积的圆的直径）、面积、周长、长宽比（长度：宽度）、圆度来表征磨屑的尺寸、形状和面积。在试验报告中，应注明磨屑形态分析时采用的放大倍数。表征尺寸小于0.1um的磨屑时，要用高分辨率的扫描电子显微镜，加速电压为3keV.放大倍数为100000倍。
注1：有必要区分纤维状和圆形的聚合物磨屑。注2：电脑或人工图形分析软件可用于确定磨屑的尺寸和形状。注3：如果微粒分析仪的分辨率达到0.1um或者更小，也可用于磨屑的尺寸和形状测定。但是，由于磨屑积聚，它们的统计尺寸有可能超过实际尺寸。4.5.2金属磨屑
4.5.2.1总则
如4.4.2中所描述，传统的磨屑分析仪器是透射电子显微镜（TEM），但也可采用扫描电子显微镜(SEM)来分析。
4.5.2.2TEM分析
用TEM对金属磨屑成像，加速电压在80kV左右，放大倍数至少21000倍（放大倍数应在试验报告中标明）。
YY/T0652—2016/ISO17853:2011手动图像分析典型的TEM显微照片（在低磨损的情况下至少150个磨屑，如果条件允许，最好有300个或者更多)，根据形状和大小表征金属磨屑。表征每张显微照片的所有磨屑，以便更准确统计不同的磨屑尺寸。确定每个磨屑的最大长度和宽度。计算出长宽比厂，得出磨屑的形状信息。磨屑可以进行粗略的分类，如果1≤r<1.5，为圆形；如果1.5≤r<2.5，为椭圆形；如果r≥2.5[5.[]，为针状。可定制软件对磨屑数据进行自动化处理。注：可以调整TEM加速电压以得到最优磨屑图像。电脑图像分析软件也可用于磨屑表征，但首先应检查其准确性（例如，至少比较一个样本的手动分析和电脑分析）。目前，手动分析比电脑分析要好，强烈推荐手动分析。4.5.2.3SEM分析
对于磨屑的SEM成像时，使用碳胶带将有磨屑的滤膜粘在SEM样品台上。对滤膜进行喷金或者镀其他导电材料，例如铂或钯，让微粒具有导电性。镀层的厚度应为3nm～5nm。用放大倍数为60000～150000的高分辨率SEM在滤膜上随机选择区域获取磨屑图像，加速电压为3keV。同TEM分析一样，手动图像分析具有代表性的SEM显微照片（至少150个磨屑），根据其形状和尺寸来表征磨屑。确定每个磨屑的最大长度和宽度。计算出长宽比「，得出磨屑的形状信息。磨屑可以进行粗略分类，如果1≤r<1.5，为圆形；如果1.5≤r<2.5，为椭圆形，如果r≥2.5，为针状。磨屑的面积也可以测量出来。可定制软件来对磨屑数据进行自动化处理。同TEM分析一样，电脑图像分析软件可用于磨屑表征，但首先应该检查其准确性（例如，至少比较个样本的手动分析和电脑分析）。目前，手动分析比电脑分析要好，强烈推荐手动分析。4.6磨屑的鉴定
4.6.1聚乙烯磨屑
可用傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）定性验证取出的磨屑，例如聚乙烯。使用FTIR之前应做好准备，将待测磨眉于燥，制成漠化钟（KB）压片或者使用显微镜附件，如果在检测的FTIR光谱中主峰与超高分子量聚乙烯的参考光谱相似，如医用级超高分子量聚乙烯粉的光谱，待测磨屑可认为是超高分子量聚乙烯（UHMWPE）磨屑。通过参考已发布的UHMWPE磨屑的图片（例如，参见ASTMF1877-059），磨屑的形貌也可作为鉴别UHMWPE磨屑的附加参考。
注：可将不同样本得到的磨屑汇集起来，以便FTIR分析时有足够的样本量。4.6.2金属磨屑
金属磨屑的成分应使用X射线能量弥散分析模块（EDXA)来确定。衍射图案也可用来确定成分。5关节模拟器润滑液中聚合物和金属磨屑的取样和分析方法5.1总则
在不同的关节模拟器和不同的试验中，作为试验介质的小牛血清用量也不同。把全部体积的小牛血清用作磨屑分析是不切实际的，所以应从已经混合均匀的试验流体中采集具有代表性的等分量的血清样本，冷冻保存备用。应保证取样时得到的小牛血清溶液含有从关节部件表面刮擦下的沉积物，使之具有代表性。另外，在取样前应搅拌试验介质。8
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