【YY医药标准】 血清总蛋白参考测量程序

ICS11.100
中华人民共和国医药行业标准
YY/T1195—2011
而血清总蛋白参考测量程序
Reference measurement procedure of total protein in serum2011-12-31发布
国家食品药品监督管理局
2013-06-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。YY/T1195—2011
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家食品药品监督管理局提出。本标准由全国医用临床检验实验室和体外诊断系统标准化技术委员会（SAC/TC136）归口。本标准起草单位：北京利德曼生化股份有限公司、北京市医疗器械检验所、上海复星长征医学科学有限公司、中生北控生物科技股份有限公司。本标准主要起草人：王兰珍、王军、吴杰、齐丽丽、杨宗兵、杜海鸥。YY/T1195-—-2011
双缩腺方法用于血清总蛋白的测量已有接近百年的历史，在此过程中很多研究人员对其测量体系进行了优化，1974年美国临床化学联合会（AACC）总蛋白研究组对此方法进行了更深入的研究，建立了血清总蛋白参考测量程序，并将研究结果在美国ClinicalChemistry杂志上连续发表。最终这一参考方法被各标准机构认可，并成为检验医学溯源联合委员会（JCTLM，JointCommitteeforTraceabilityinLaboratoryMedicine)推荐的血清总蛋白参考测量程序。本标准根据此参考测量程序制定。
1范围
血清总蛋白参考测量程序
本标准用于血清中总蛋白含量的定量测量。2规范性引用文件
YY/T1195—2011
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法JF1059-1999测量不确定度评定与表示3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
analytical sensitivity
分析灵敏度
测量程序的灵敏度sensitivity of ameasurementprocedure测量示值变化除以相应的被测量值变化所得的商。注1：测量程序的灵敏度有可能依赖于被测量值。注2：要考察的被测量值改变必须大于分辨率。注3：一个测量系统的分析灵敏度是校准曲线的斜率。注4：分析灵敏度不应被用于表示检出限或定量限，并且不应与诊断灵敏度混。[ISO18113-1.2009,定义A3.3]
linearity of a measuring system测量系统的线性
线性linearity
给出与样品中被测量的值直接成比例的测得量值的能力。注1：对于体外诊断医疗器械，线性与测量示值校正或线性化后给定测量区间内的测量结果有关，注2：线性通过测量包含配方已知或相对关系已知（不必绝对知道）的被测量样品来评估。当测量结果相对被测量绝对或相对数值作图时，所划曲线对直线的符合程度即线性度的量度。[ISO18113-1.2009，定义A3.21]3.3
影响量influencequantity
在直接测量中，不影响实际被测量的量，但影响示值和测量结果间关系的量。示例1：在血红蛋白浓度直接测量中人血浆的胆红素浓度。示例2：在物质的量分数测量中质谱仪离子源的背景压力。注1：间接测量中包含直接测量的组合，其中每一个测量都可受到影响量的影响。注2：在GUM中，影响量概念的定义如同以前版本的VIM，不仅涵盖影响测量系统的量，如上述定义，而且包括那些影响实际被测量基的量。此外，在GUM中这个概念不限于直接测量。1
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［ISO18113-1:2009,定义A3.18]3.4
系统测量误差
systematie measurement errorsystematic error
系统误差
在重复测量中保持恒定或以可预见方式变化的测量误差分量。注1：对系统测量误差参考量值是真值，或测量不确定度可忽略的测量标准的测得量值，或约定量值。注2：系统测量误差及其来源可以是已知或未知的，对于已知的系统测量误差，可用修正值予以补偿。注3：系统测量误差等于测量误差减去随机测量误差。［ISO18113-1:2009定义A3.54]
f measurement uncertainty
测量不确定度
测量的不确定度uncertaintyofmeasurement根据所用信息，表征赋予被测量量值分散性的非负参数。注1：测量不确定度包含来自系统效应的分量，如与修正和测量标准指定量值相关的分量，以及定义的不确定度。有时估计的系统效应不被修正，而是纳人相关的测量不确定度分量。注2：此参数不能是负数。此参数可以是如称为标准测量不确定度的标准差（或它的指定倍数），或说明了包含概率的区间的半宽度。
注3：由测量模型中输人量的测量结果得到的标准测量不确定度称为合成标准测量不确定度。合成标准测量不确定度与一个大于数字1的包含因子的积在ISO/IEC指南99：2007，2.35中被称为扩展测量不确定度，在BIPM关于不确定度表述工作组中被称为总体不确定度，在IEC文件中被简单称为不确定度。注4：在ISO/IEC指南99：2007，2.27中由被测量定义中的有限量细节引起的最小测量不确定度被称为“定义不确定度”，在GUM和IEC60359中此概念被称为固有不确定度。注5：测量不确定度通常由许多分量组成。其中一些分量可采用测量不确定度的A类评定，即由一系列测量的测得量值的统计学分布来评定，并可用标准差来表征。其他一些分量可采用测量不确定度的B类评定，通过基于经验或其他信息的概率密度函数来评定，也可用标准差来表征（见ISO/IEC指南99：2007，2.26，注3)。注6：测量不确定度、该测量不确定度的分量以及它们的计算与合成的说明称为不确定度预估。一个不确定度预估“典型地包括测量模型、在该模型中量的估计值和测量不确定度、协方差、所用的概率密度函数、自由度、测量不确定度评定的类型以及任何包含因子（见ISO/IEC指南99：2007，2.33)。注7：一般认为，对于一组给定信息，测量不确定度与赋予被测量的一个规定量值相关。此值的修改引起相应不确定度的修改。
[ISO18113-1:2009，定义A3.35]3.6
测量准确度measurementaccuracy准确度accuracy
一个测得量值与被测量的一个真量值间的一致程度。注1：概念“测量准确度”不是一个量，并且不给它数字量值。当一个测量给出较小的测量误差时说它较准确。注2：术语“测量准确度”不应用于测量正确度，并且术语“测量精密度”不应用于测量准确度，然而测量准确度与两概念都有关。
注3：测量准确度有时候被理解为被赋予被测量的测得量值间的一致程度。[ISO18113-1:2009,定义A3.24]
测量偏倚
偏倚bias
measurement bias
系统测量误差的估计值。
注1：偏倚反相关于正确度。
注2：偏倚的估计是一系列测量值的平均值减去参考量值。［ISO18113-1.2009，定义A3.25]测量精密度
measurementprecision
精密度precision
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在规定条件下，对同一或相似被测对象重复测量得到测量示值或测得量值间的一致程度。注1：测量精密度通常由不精密度的量度以数字表达，如规定测量条件下的标准差、方差和变异系数，注2：规定的条件可以是，例如，测量的重复性条件，测量的中间精密度条件，或测量的再现性条件。注3：测量精密度用于定义测量重复性，中间测量精密度和测量再现性。注4：重复测量指在同一或相似样品上以不受以前结果影响的方式得到的结果。【ISO18113-1:2009，定义A3.29measurement repeatability
测量重复性
重复性repeatability
在一组测量条件下的测量精密度，包括相同测量程序、相同操作者，相同测量系统、相同操作条件和相同地点，并且在短时间段内对同一或相似被测对象重复测量。注1：在临床化学上，术语批内或序列内精密度有时用于指此概念。注2：在评估体外诊断医疗器械时，通常选择重复性条件来代表基本不变的测量条件（被称为重复性条件），此条件产生测量结果的最小变异。重复性信息可对故障排除目的有用处。注3：重复性可以用结果分散性特征术语定量表达，如重复性标准差、重复性方差和重复性变异系数。［ISO18113-1.2009，定义A3.303.10
measurement reproducibility
测量再现性
再现性reproducibility
在包括了不同地点，不同操作者、不同测量系统的测量条件下对同一或相似被测对象重复测量的测量精密度。
注1：在临床化学上，术语室间精密度有时用于指此概念。注2：在评估体外诊断医疗器械时，通常选择再现性条件来代表最大改变的条件（被称为再现性条件），此条件产生独立实验室间比较结果时遇到的测量结果变异，如发生在室间比对计划中（例如；能力比对、外部质量保证或实验室标准化试验）
注3：再现性可以用结果分散性特征术语定量表达，如再现性标准差、再现性方差和再现性变异系数。注4：不同测量系统可使用不同测量程序。注5：应在实际程度上给出改变或不改变条件的说明。[ISO18113-1:2009,定义A3.31]
检出限detection limit,limit of detection由给定测量程序得到的测得量值，对于此值，在给定错误地声称物质中存在某成分的概率为α时，错误地声称不存在该成分的概率为β。注1：IUPAC建议α和β默认值等于0.05注2：术语分析灵敏度”（A.3.3）有时被用于代表检出限，但现在不鼓励这样的用法。【ISO18113-1.2009定义A3.14
定量限quantitation limit limit of quantitation在规定的测量条件下以指定的测量不确定度能测量的样品中可被测量的最低值。注1：在体外诊断标示中，有时候也被用来指测量下限，定量下限，测量下限。注2：不鼓励使用术语“功能灵敏度”表示此概念。[ISO18113-1.2009,定义A3.44]
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测量原理
蛋白溶液在25℃、碱性条件与铜离子反应生成紫色络合物，该物质在540nm有特征性吸收峰。此反应是蛋白和多肽的特征性反应。蛋白溶液中的总蛋白含量在一定范围内与其540nm处的吸光度成正比。
5试剂
5.1通用要求
应使用分析级别的试剂和GB/T6682-2008中规定的至少3级试验用水。5.2试剂配制
5.2.1最终反应液主要成分及浓度最终反应液主要成分及浓度见表1所示。5.2.2
主要原料
主要原料见表2所示。
表1最终反应液主要成分及浓度
样本空白液
KNaC.H.O4H.O
CuSO..5H20
KNaC.H.O.·4Hz
英文名称
Sodium
hydroxide
Copper(ID)
sulfate
pentahydrate
Potassium
sodium
tartrate
tetrahydrate
Potassium
iodide
中文名称
氢氧化钠
硫酸铜
酒石酸钾钠
碘化钾
样本测量液/试剂空白液
2主要原料
CAS号
1310-73-2
7758-99-8
6381-59-5下载标准就来标准下载网
7681-11-0
化学式/分子式
CusO.·5H,0
KNaCH,O·4HO
0.59mol/L
0.59mol/L
摩尔质量
储存条件
分析纯
分析纯
分析纯
分析纯
配制方法
5.2.3.1NaOH,6.0mol/L
5.2.3.1.1配制步骤：将240g士2g的NaOH溶解在新制备的水中，定容至1L。5.2.3.1.2储存：室温保存在密闭的聚乙烯塑料瓶中。5.2.3.1.3保质期：6个月。
5.2.3.1.4可接受标准：溶液澄清。YY/T1195—2011
注建议使用未开封的NaOH配制。若使用已开封的试剂，则应确保试剂无潮解且无NazCOs。5.2.3.2双缩脲试剂
5.2.3.2.1配制步骤：在500mL新制备的水中溶解3.00g士0.01g的CuSO。*5H2O。然后加人9.00g士0.01g的KNaC,H.O。·4H,O和5.0g士0.1g的KI。待溶解完全后，加人100mL6mol/L的NaOH，最后定容到1L
5.2.3.2.2储存：室温保存在密闭的聚乙烯塑料瓶中，建议在6个月内使用。若要使用超过6个月的试剂，应先经过验证。
5.2.3.2.3可接受标准：5.0mL双缩腺试剂中加人100μL水，混勾后在波长为540nm处测量，用碱性酒石酸钾钠溶液调零，吸光度在0.095～0.105范围内。5.2.3.3碱性酒石酸钾钠溶液
5.2.3.3.1配制步骤：溶解9.00g士0.01g的KNaCH.O。·4H2O和5.0g士0.1gKI到800mL水中，加人100mL6mol/L的NaOH，然后用水定容到1L。5.2.3.3.2储存：室温保存在密闭的聚乙烯塑料瓶中。5.2.3.3.3保质期：6个月。
5.2.3.3.4可接受标准：溶液澄清。6仪器
程序所需要的主要仪器的基本性能特征见表3。表3主要仪器的基本性能特征
仪器名称
分光光度计
容量瓶
移液器
程序所需用的辅助设备的基本性能特征见表4。表4
设备名称
比色血
恒温水浴箱
基本性能特征
带宽≤2nm，吸光度精度0.0001.检定合格检定合格
A级，检定合格
检定合格
辅助设备的基本性能特征
基本性能特征
石英比色皿，光径（10.0士0.1)mm10mL，塑料材质
25℃±1℃
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7分析样本
标准物质：国家或国际有证参考物质，如SRM927d。7.2
空白物质：水。
控制物质：牛血清或人血清基质的控制物质。样本：新鲜或冰冻人血清。
参考测量程序的操作
总体测量说明
在总蛋白测量中需测量样本吸光度（A），试剂空白吸光度（A.）、样本空白吸光度（A，）。样本吸光度（A）为待检样本和双缩腺试剂反应后的吸光度。试剂空白吸光度（A，）为与待检样本同体积的水和双缩腺试剂混合后的吸光度。样本空白吸光度（A，）为待检样本与碱性酒石酸钾钠溶液混合后的吸光度。样本的吸光度等于A-Az\A，样本空白吸光度等于A1，试剂空白吸光度等于A2。所有样本、控制物质、样本空白和试剂空白均应作双份测量。在一个分析批内应进行两次定标测量，一次在分析前，一次在分析后，每次定标测量均应作双份测量。为避免携带污染，在每个测量组中，应先做样本空白，再作样本测量。
8.2样本处理程序
8.2.1样本空白（A,）
8.2.1.1吸取5.0mL碱性酒石酸钾钠溶液到10mL试管中；8.2.1.2将100μL样本、标准物质、控制物质等分别加入上述试管中。注意在操作中如采用手动移液器，至少用碱性酒石酸钾钠溶液润洗三次，已保证所有样本均已转移到试管中。按照固定的时间间隔依次操作，确保在吸光度测量时，以同样的顺序和时间间隔进行测量；8.2.1.3将试管封口，轻轻混勾内容物。让试管在25℃水浴中放置60min。8.2.2试剂空白（A2）
用水替代样本、双缩脲试剂替代碱性酒石酸钾钠溶液，按照8.2.1的程序进行。8.2.3样本（As）
用双缩腺试剂替代碱性酒石酸钾钠溶液，按照8.2.1的程序进行。8.3吸光度测量
分光光度计开机预热30min以上，仪器工作正常后进行下面实验。按表5设置参数。表5仪器参数设置
8.3.1用碱性酒石酸钾钠溶液调零；6
≤2nm
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8.3.2用塑料吸管将比色血中内容物全部吸出，然后用另一干净吸管加入待测溶液，润洗2次。最后加人待测溶液，读取吸光度；
8.3.3按照图1规定的顺序，依次读取A2，A，和A碱性酒石酸溶液调零
检测试剂空白吸光度A2
检测标准物质样本空白吸光度As1检测标准物质吸光度As3
检测控制物质样本空白吸光度Acl检测控制物质吸光度Ac3
检测样本的样本空白吸光度A
检测样本吸光度As
标雅物质检训
8.4原始数据的有效性检查
检测标准物质样本空白吸光度As!检测标准物质吸光度As3
程序的操作流程图
获得原始数据后，应对其有效性进行检查。原始数据满足以下两个条件时，数据有效：就同一样本的两次读数差值在0.005以内，超过此范围数据无效；a)
所有的标准物质的四次测量读数极差在0.007以内，且至少有3次在0.005以内。如果不符合要求，重新测量标准物质4次。如果前后2批标准物质吸光度均值的差值超过0.005，表明漂移不可接受，所有测量无效。8.5程序的简略表述
对程序的简略表述见图2。
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9数据处理
原始数据的处理
设备开机及检查
碱性酒石酸钾钠溶液调零
检测试剂空白A2
检测标准物质样本空白AsI及标准物质As检测控制物质或样本的样本空白A1及As检测标准物质样本空白-As1及标准物质As3数据有效性检查
图2程序的简略表述
按式（1)得出样本的校正吸光度。A=A—AA
式中：
一样本的校正吸光度。
对于每一个样本测量A，的均值减去两次A，的均值，及其对应样本空白A，的均值；标准物质校正吸光度的处理参照样本校正吸光度进行。样本浓度的计算公式
按式(2)计算样本浓度。
式中：
样本的浓度，单位克每升（g/L）；Cs
标准物质的浓度，单位克每升（g/L）；As标准物质的校正吸光度。
9.3测量不确定度
根据JF1059—1999进行测量不确定度评定。8
（1）
9.4有效数字的位数和数值修约
按以下原则对结果进行有效数字位数的保留及数值修约。a）原始吸光度数据保留4位有效数字。校正吸光度保留4位有效数字。
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测量结果一般表示为：标准值士扩展不确定度。扩展不确定度按照“只进不舍”的原则保留1位～2位有效数字，标准值的最后一位与扩展不确定度相应的位数对齐来决定标准值的有效数字位数。
10分析可靠性
10.1分析灵敏度
本参考测量程序的分析灵敏度为：1g/L血清总蛋白的吸光度为0.0057士0.0002。10.2分析测量函数
本参考测量程序的分析函数见式（2)。10.3线性
本参考测量程序线性可达到150g/L，线性相关系数（r）应大于0.999。10.4空白吸光度
本参考测量程序的空白吸光度包括试剂空白吸光度和样本空白吸光度。其中，试剂空白吸光度在0.095～0.105范围内。
10.5测量不确定度
测量准确度用不确定度表示，本程序的相对扩展不确定度应小于2%。10.6重复性
测量总蛋白含量在60g/L～80g/L的样品，重复性变异系数（CV)应小于1%。10.7
重现性
测量总蛋白含量在60g/L80g/L的样品，重现性变异系数（CV)应小于2%。10.8空白限
空白限应小于0.001（置信概率95%下的吸光度值）。10.9测量低限和高限
测量低限为15g/L，测量高限为150g/L。10.10错误来源
错误的主要来源如下：
a）仪器状态：仪器出现异常状态；b）试剂配制不当：
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