【SN商检标准】 桃色欧文氏菌检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3965—2014
桃色欧文氏菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Erwinia persicina Hao el al2014-04-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-11-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准山国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、江西农业大学。本标推主要起草人：冯黎霞、崔汝强、何日荣、武目涛王卫芳、钟国强。SN/T3965—2014
1范围
桃色欧文氏菌检疫鉴定方法
本标准规定了进出境植物检疫中桃色欧文氏菌的检疫鉴定方法。SN/T3965—2014
本标准适用于可能携带桃色欧文氏菌的水果、种子以及苗木等繁殖材料的检疫和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1809进出境植物种子检疫规程3方法原理www.bzxz.net
桃色欧文氏菌（Erreinia persicina Hao et al.）属肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、欧文氏菌属（Erinia）。该病菌可以通过种子进行远距离传播。该病菌的生物学、生理生化和分子生物学特性是制定本标准的主要依据（见附录A）4仪器设备和用具
4.1仪器设备
生物显微镜、超净工作台、高压灭菌器、离心机、超低温冰箱、常规冰箱、恒温培养箱、PCR仪、电泳设备及其他常规实验室设备。
4.2用具
剪刀、解剖刀、接种针（环）、镊子、玻棒、培养血、酒精灯、三角烧瓶、量筒、移液器。5主要试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。桃色欧文氏菌所用的培养基配方和试剂详见附录B和附录C。6
检疫鉴定方法
6.1田间调查和植株检验
田间调查时采集具可疑症状的植株或果实带回实验室，用清水清洗干净，切取病健交界部位的组织，用灭菌水冲洗1次，75%乙醇消毒60s，无菌水冲洗3次，然后将其移至灭菌培养血中，加少量无菌SN/T 3965—2014
水，用无菌玻棒挤压或用无菌剪刀将其剪碎，用接菌环蘸取菌液划线接种于NVA培养基平板[，28℃培养48h。挑取优势单菌落进行纯化。6.2种子处理
对来白桃色欧文氏菌发生国家租疫区（见附录A）的种了按照S.V/T1809的规定进行检疫抽样。随机选取种十15～100g浸泡在无菌水中（按1：5质量体积比），4℃过夜，并用无菌水清洗种子2次，将浸泡液和洗液一并向收至离心管中，然后在4℃下6000g离心10min，去.上清液.沉淀悬浮于2InL菌水中-分别稀释10°、10°10°倍后在1/5NA培养基上涂半板。28℃培养24h-~72h，每天观察菌落生长状况，纯化单菌落。或者取每份种子1000粒用无菌水保凝培养种植于温室或光照培养箱中，生长温度为25℃～28℃，相对湿度大于或等于70%，种子出茵后一周观察植株感病情况。病变组织处理和病原菌分离培养参照6,1。6.3病原菌的分离培养
根据附录A桃色欧文氏菌在 NA培养基上的菌落特征,挑取可疑的单菌落,在KB培养基或NA培养基上划线纯化，28℃培养24h～48h,对可疑分离物的菌落特征进行观察和描述记载，并按照6.4.6.5、6.6步骤操作。
6.4致病性测定
分离纯化的菌株在NA平板上28培养48h后，用无菌水配成10CFTJ/mI.-10°（CFUJ/ml.的新鲜菌悬液，通过针刺或注射等方法接种键康寄主，用无菌水接种健康植株叶片做阴性刘照。置丁光照培养箱内，26℃，相对湿度80%，光照12h，每天观察发病情况。6.5生理生化测定
将可疑分离物菌株进行生理生化试验，其体生理生化指标见附录A。6.6PCR检测
对可菌株进行PCR检测，以桃色欧文氏菌标准菌株作阳性对照，以双蒸水作空白对照，进行PCR扩增.扩增产物进行电泳分析。若可疑菌株与阳性对照扩增有253bl条带，空白对照无条带，回收特异性片段进行测序，并利用Blast 进行序列比对分析。7结果判定
所分离的细菌菌株菌落特征与描述相符,且至少采用致病性测定(见 6.4)、生化试验(见 6,5)、分子生物学(见 6,f)其中两种以上方法的鉴定,复核，结果为阳性若：判定为检出桃色欧文氏菌；否则为末检出。
8样品保存
8,1样品保存与处理
样品经登记和经手人签宰后妥善保存。对检出桃色饮.文氏病菌的样品应保存于1℃冰箱中，以备复核，该类样品保存期满后应经压灭菌后方可处理，2
-iKAONiKAca
菌株保存与处理
SN/T3965—2014
从检测样品中分离并鉴定为桃色欧文氏菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种于KB培养基斜面上，28℃培养481,然后4℃冰箱保存，或液体培养至对数牛长期，加人20%灭菌甘油并混勾，-80℃长期保存或用安额管冷冻下燥长期保存。对不需要长期保存的菌株应及时高压火菌处理。9结果资料与记录保存
完整的实验记录包括样品来源,种类、时问，实验的时闽、地点，力法和结果等，并要布检測人员、串核人员的签字。生物学测定需要症状、菌落培养等照片,PCR检测需要电泳照片和序列测定结果。3
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A.1名称
附录A
（规范性附录）
桃色欧文氏菌其他信息
学名：Erwinia persicina Hao etal.名:Erwinia persicinus Hao etal.,Erwinia nulandiz Schuster et al.A.2症状特征
豌豆：桃色欧文氏菌可引起豌豆叶片及卷须褪绿坏死，叶片背面有褐色坏死枯斑，有明亮光泽。菜豆：可造成植株萎為，叶片沿叶脉变色、黄化，有坏死斑，在叶片背部有坏死斑点，叶片往往卷曲、畸形，叶片上有明显的疱状突起。在豆英和种子上有坏死斑点。番茄：叶片沿叶脉变色、坏死、干枯，植株蒸秆产生不定根。在发病初期，叶片和茎秆上有很小的紫色斑点，叶背部出现银色坏死斑瓜类：叶片有疱状突起，植株叶片沿叶脉变色、坏死、干枯，植株藤上有损伤病斑。在发病初期，感病植株叶背部出现银色坏死斑，叶片向内卷曲，茎秆上生满不定根，尤其是根部。A.3寄主范围
菜豆（Phaseolusvulgaris
、豌豆（Pisumsatiuum）、棉花（Gossypiumspp.）、葱（Alliumfistulosum）、茄子（Solanummelongena），番茄（Solanumlyepersicum）、黄瓜（Cucumissatiuus）、香蕉（Musaparadisiaca）、水稻（Oryza sativa）、工米（Zea mays）、紫花首（Medicago sativa）等作物。A.4分布
美国、日本、西班牙、澳大利亚等国家和地区5病原菌培养形状及形态特征
细胞为直杆状，菌体大小为（0.5μm~1.0μm）×（1.0μm~3.0μm）。革兰氏染色阴性，无芽孢，无英膜，兼性厌氧型，能运动。最适生长温度为28℃～30℃，36℃能生长，能在5%NaC1营养肉汤中生长。在NA培养基上菌落小，呈桃红色或黄色，圆形，表面凸起，光滑不透明，边缘整齐。A.6
生理生化特性
发酵型，能从葡萄糖、阿拉伯糖、乳糖、棉籽糖、鼠李糖、甘露醇、蔗糖、甘油产酸，不能从木糖、肌醇、松三糖、苦杏仁苷产酸。氧化酶阴性，接触酶阳性。还原硝酸盐。不能液化明胶，不产生吲哚、精氨酸双水解酶、苯丙氨酸脱氨酶以及脲酶。V-P阳性，ONPG阳性。水解酪蛋白。能利用柠檬酸盐。4
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B.11/5NA培养基（pH7.2)
附录B
（规范性附录）
桃色欧文氏菌常用的培养基配方SN/T3965—2014
蛋白陈10.0g，牛肉膏0.2g，酵母粉0.4g，氯化钠（NaCl)1.0g.琼脂17.0g，蒸馏水1000mL：121℃湿热灭菌20min。
B.2NA培养基（pH7.2)
蛋白陈10.0g，牛肉膏3.0g，酵母粉0.4g，化钠（NaCl）5.g，琼脂17.0g，蒸馏水1000mL，121℃湿热灭菌20min。
KB培养基（pH7.2）
蛋白陈20.0g，甘油10.0g，硫酸镁（MgSO7HLO）1.5g，磷酸氢二钾（K，HPO）1.5g，琼脂15.0g.蒸水1000mL，121℃湿热火菌20min。B.45%营养肉汤（pH7.2）
牛肉膏3.0g，蛋白陈5.0g，氯化钠（NaCl)5.0g·蒸馏水1000mL，121℃湿热灭菌20min。5
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C.1 PCR 反应模板制备
附录C
(规范性附录）
PCK 检测方法
称取感病的植物组织10αmg，放入离心管中加人1mL双蒸水振荡洗涤10min后，吸取[:清液，4000g离心5min，去上清液，加人100μL双蒸水和900μL0.1%的吐溢-80，丁100℃水浴巾煮沸8min,取1.清液作为模板DNA。
或者直接用培养的菌株稀释悬浊液作为模板进行PCR反应。待检测菌落经28C振荡培养24h后，取菌液1nL，400Gg离心5 min，去上清液，加人双蒸水100 uL，于100℃水浴中点沸8nmin，12 oU0 r/min离心5 nin,取上清羧作为模板DNA。2PCK检测
C.,2,1 检测用引物
参考1.Gehring（2012）发表的可引物序列recA-5/recA-5c引物序列为：IccA-5（5'-GTCAT-CATCCTCGACTCCGTA-3'）,rccA-5c(5'-CCAGACGGACAGAAGCGTAG-3')，扩增产物253 bP。C.2.2 PCR反应体系
PCR反应体系见表C.1。
表 C.1 PCR反应体系
试剂名称
10XPCR 反应缓冲液
dNTPs (2.5 mmol/1.)
引物 recA-5 (10 mmol/1.)
物ICA-5（10IInOl/L)
Ta DNA 聚合酶( U/L)
DNA模板
补ddH,至
C.2.3PCR 反应程序
2.5 μl.
TμL
1 μl
1μl.
0.a μL
C.5 μl.
25 μl.
95 /3 min; 94 ℃/30 s,63 ℃/30 s,72 ℃/30 s.# 10 循环,94 /30 s,58 C/30 s,72 ℃/30 s20循环；72℃/10min。
注：不同仪器可报据仪器要求将反应参数作适当调整6
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C.2.4PCK反应扩增产物的检测
SN/T39652014
将 5 tL PCR产物用 12 g/ L琼脂糖凝胶电泳分离.经 DNA染料染色后于紫外凝胶成像系统下根据扩增产物的大小判定结果，并拍照，记录实验结果。PCR产物经纯化后，送生物公司测序。PCR产物测序，测序结果与GenBeank中的已知序列进行T3last 比较。SN/T3965—2014
参考文献
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