【SN商检标准】 烟草脆裂病毒检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3440—2012 烟草脆裂病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of tobacco rattle virus 2012-12-12发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 2013-07-01实施 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：于翠、杨翠云、冯藜霞、李桂芬、廖富荣、戚龙君。 1 范围 本标准规定了烟草脆裂病毒的DAS-ELISA、RT-PCR、鉴别寄主反应和免疫电镜四种检测和鉴定方法。 本标准适用于进出境活体植物材料，包括无性繁殖材料、组培苗、种子和苗木中烟草脆裂病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1840 植物病毒免疫电镜检测方法 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 原理 3.1 烟草脆裂病毒基本信息 中文名：烟草脆裂病毒 学名：Tobacco rattle virus 缩写：TRV 分类地位：烟草脆裂病毒属（Tobravirus） 烟草脆裂病毒的其他信息参见附录A。 3.2 检疫鉴定依据 烟草脆裂病毒的粒子形态特征、为害症状、血清学特性和分子生物学特征是检疫鉴定该病毒的主要依据。采用DAS-ELISA、RT-PCR、免疫电镜和鉴别寄主反应等方法进行检疫鉴定。 4 仪器、设施、用具和试剂 4.1 仪器 PCR仪、酶标仪、电子天平（1/1000g）、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、电子透射显微镜、水浴锅、高速冷冻离心机、-80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、涡旋振荡器等。 4.2 设施 隔离检疫温室（10℃～30℃）。 4.3 用具 可调式微量移液器（2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL、5000μL）及相应的无RNase吸头、无RNase离心管、PCR管、研钵、样品袋、标签、镊子、放大镜等。 4.4 试剂 TRV抗体、Trizol、焦碳酸二乙酯（DEPC）、液氮、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、75%乙醇、β-巯基乙醇、AMV反转录酶、Taq DNA聚合酶、DNA分子标记、溴化乙锭、琼脂糖、溴酚蓝等。 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。血清学和分子生物学检测试剂配制见附录B。 5 症状观察及抽样 5.1 症状观察 现场检疫主要观察植物材料上病毒为害的症状，TRV为害症状描述参见附录A。 5.2 抽样 取有疑似病毒症状的植物不同部位（如叶、枝等）分别进行单独检测。没有症状或无法观察症状的植物产品，则按SN/T2122中规定进行抽样，并送实验室进行检疫鉴定。 6 检测鉴定方法 6.1 双抗体酶联免疫吸附测定法（DAS-ELISA） 对种苗叶片或由种子催生长出的第一对真叶进行研磨，并按植物组织重量与抽提缓冲液1:10的比例稀释。制备的汁液分别盛装于离心管中，低速离心后吸取上清液用于ELISA检测。具体检测步骤见附录C。 6.2 RT-PCR检测 样品用液氮研细，取0.1g用于提取植物总RNA。RT-PCR具体操作步骤见附录D。 6.3 鉴别寄主接种 在栽种于隔离检疫温室中的鉴别寄主植物真叶长出后用于摩擦接种。将可疑样品加入适量接种缓冲液研磨成汁液后用于接种。当任意一种鉴别寄主出现如下描述症状时，判定带有TRV： 色藜（Chenopodium amaranticolor）或昆诺藜（Chenopodium quinoa）：局部坏死斑在3d～5d即可形成，有些具有扩散趋势，绝大多数分离物为局部侵染。 黄瓜（Cucumis sativus）：褪绿或局部坏死斑，非系统性侵染。 烟草（Nicotiana tabacum cv. Samsun NN）：接种叶片典型症状为坏死斑或坏死环，以及系统性的扭曲和坏死。然而症状同时受到环境条件影响，一些病株产生症状较轻或根本不产生症状。 菜豆（Phaseolus vulgaris）：2d～4d可形成局部坏死斑，非系统性侵染。 6.4 免疫电镜检测 按照SN/T1840中的方法进行电镜观察。如观察到直径为20nm～23nm、长度为78nm～114nm或185nm～197nm的刚直杆状病毒粒子，则判定免疫电镜结果为阳性。 7 结果判定 7.1 当6.1、6.2、6.3和6.4中两项或两项以上检测结果为阳性时，可判定该样品携带烟草脆裂病毒（TRV）。