【SN商检标准】 藜草花叶病毒检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3436—2012 藜草花叶病毒检疫鉴定方法 Detection and Identification of Sowbane Mosaic Virus 发布日期：2012-12-12 实施日期：2013-07-01 发布单位：中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：陈青、李桂芬、黄峰、陈红运、廖富荣、林石明。 1 范围 本标准规定了藜草花叶病毒检疫鉴定的血清学和分子生物学检测方法。 本标准适用于可能携带藜草花叶病毒的植物种子、苗木及植物产品的检疫鉴定。 2 原理 学名：Sowbane Mosaic Virus。 缩写：SoMV。 分类地位：南方菜豆花叶病毒属（Sobemovirus）成员。 抗原特性和基因组特征是检疫鉴定的主要依据，详细资料见附录A。 3 仪器、设备与试剂 3.1 仪器设备和用具 微量研磨仪、酶标仪、洗板机、微量天平（感量0.001 g）、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽、pH计、可调移液器（1000 μL、200 μL、20 μL、2 μL）、96孔酶标板、研钵等；防虫温室。 3.2 试剂 主要试剂和缓冲液见附录B和附录C。 4 检测样品的制备 4.1 种子样品制备 挑取畸形、不成熟种子播于灭菌土中，待长出3～4片叶后，将表现症状的植株编号；未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。采集叶片分成2份，根据需要分别用于酶联测定和分子生物学检测。 也可挑取畸形、不成熟种子直接进行酶联测定和分子生物学检测。 4.2 苗木 有症状（如叶片畸形、花叶、斑驳等）的苗木应编号并单独检测。无症状苗木应分组编号检测，分组方法和检测方法同4.1。 4.3 植物产品 植物产品有症状的部分（如叶片畸形、花叶、斑驳等）应单独编号检测。无症状或无法观察症状的植物产品，应按比例取样并分组编号，分组方法和检测方法同4.1。 5 检测与鉴定 5.1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA） 将制备好的样品上清液加入已包被SoMV抗体的96孔酶联板中进行DAS-ELISA检测，每个样品平行加入两个孔。 设置阴性对照和阳性对照：健康植物组织作为阴性对照，感染SoMV的植物组织作为阳性对照；样品提取缓冲液作为空白对照。阴性对照的材料种类（如种子或叶片）应尽量与检测样品一致。 不同检测试剂或试剂盒应按照其说明书进行操作，具体方法见附录B。 5.2 RT-PCR检测 分别提取样品和对照的总RNA。健康植物组织作为阴性对照，感染SoMV的植物组织作为阳性对照。按照规定进行反转录和PCR扩增检测，具体方法见附录C。 6 结果判定 当两种检测方法结果均为阳性时，即可判定样品携带藜草花叶病毒（SoMV）。 一般情况下，酶联免疫吸附测定结果为阳性后，再进行RT-PCR检测；当RT-PCR检测结果为阳性时，可判定样品带有藜草花叶病毒。必要时可进一步进行生物接种试验。 7 结果记录与样品保存 7.1 结果记录 完整的实验记录应包括：样品来源、种类、取样时间、检测方法、检测结果等内容，并应有经手人和实验人员签字。 酶联免疫吸附测定应保存原始吸光度数据；PCR检测应保存电泳结果照片。 7.2 样品保存 经检验确认携带SoMV的样品应妥善保存并做好标记和登记。种子样品宜保存在-80℃冰箱中；病叶可采用冻干方式保存于20℃或适宜条件下长期保存。 附录A（资料性附录） 藜草花叶病毒相关资料 A.1 学名和分类地位 学名：Sowbane Mosaic Virus。 缩写：SoMV。 分类地位：南方菜豆花叶病毒属（Sobemovirus）成员。 A.2 抗原特性 SoMV具有较强抗原性。 A.3 粒体形态 藜草花叶病毒粒体呈球形，直径约39 nm。 A.4 基因组 该病毒粒体包含约20%的核酸和80%的蛋白质。基因组为单链RNA（ssRNA），长度约4.2 kb。 核苷酸组成约为：G占26%、A占27.2%、C占23.2%、U占23.2%。 病毒基因组为单分体基因组，其RNA的3′端无Poly(A)结构，也无tRNA样结构；RNA的5′端具有VPg蛋白，该结构可能是病毒侵染所必需的。 A.5 寄主范围 藜草花叶病毒寄主范围较有限，自然寄主主要为藜科（Chenopodiaceae）植物。但在欧洲也发现部分果树和葡萄可感染藜草花叶病毒。研究表明，来源于葡萄的病毒分离物可通过人工接种侵染其他科植物。 A.6 病害症状 昆诺藜：系统侵染，叶片出现斑驳、褪绿斑点、畸形，植株矮化。 苋色藜：系统侵染，叶片出现斑驳、褪绿斑点、畸形，植株矮化。 菠菜：可出现花叶、斑驳、褪绿及生长受抑等症状。