【行业标准】 马病毒性动脉炎检疫技术规范

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1142—2011
代替SN/T1142—2002,SN/T1377—2004马病毒性动脉炎检疫技术规范
Quarantineprotocol for equineviral arteritis2011-05-31发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-12-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T 1142—2011
本标准代替SN/T1377—2004《从精液中分离马病毒性动脉炎病毒试验操作规程》和SN/T1142—2002《马病毒性动脉炎微量血清中和试验操作规程》。本标准与SN/T1142—2002和SN/T1377—2004相比，主要的技术变化如下：增加了血液、组织中的病毒分离；一增加了酶联免疫吸附试验方法；-增加了荧光RT-PCR试验方法。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：梁成珠、朱来华、郑小龙、李西峰。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-SN/T1142—2002;
SN/T1377—2004。
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1范围
马病毒性动脉炎检疫技术规范
SN/T 1142—2011
本标准规定了马病毒性动脉炎的病毒分离鉴定、微量血清中和试验、酶联免疫吸附试验和荧光RTPCR试验等方法。
本标准适用于进出境马属动物病毒性动脉炎的诊断和检疫。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489—2008实验室生物安全通用要求缩略语
下列缩略语适用于本文件。
RK-13:兔肾细胞
PBS:磷酸盐缓冲生理盐水
CPE:细胞病变反应
EAV:马病毒性动脉炎病毒
TCIDso：半数组织感染量
ELISA：酶联免疫吸附试验
RealtimeRT-PCR：荧光反转录-聚合酶链式反应4临床诊断
4.1临床特征
发病马的临床症状表现不一，一般为发热，精神沉郁，食欲不振，流异液，流泪，结膜炎，眼脸水肿，额下淋巴结肿大，白细胞减少，四肢特别是后肢下端水肿，雄马阴囊及包皮肿胀，妊娠马流产。老龄雌马和营养状况差的马临床症状较重，妊娠马比空怀雌马症状明显。如果妊娠马群发生EAV流行，流产率可高达40%~59%。
4.2判定
根据4.1临床检查可作出初步判定，确诊需进行实验室检测。1
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5病毒分离鉴定
5.1仪器设备
超净工作台或生物安全柜、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、液氮贮存罐、蔡氏滤器和微孔滤膜（0.22um）、高压灭菌锅、离心机、超声波破碎仪、微量细胞培养板（96孔）、微型振荡器、微量可调移液器(200μL）、电子天平、细胞瓶和吸管（1mL、2mL、5mL、10mL）等。5.2试剂与材料
MEM培养基、抗生素贮存液、细胞消化液、细胞培养液和细胞维持液、1%细胞染色液、7.5%羧甲基纤维素、红细胞裂解液、磷酸盐缓冲液（PBS）、兔肾细胞（RK-13）、马病毒性动脉炎病毒（EAV)标准病毒株（Bucyrus株）和各种常规试剂等，试剂配制见附录A。5.3样品采集与处理
5.3.1样品采集与运送
无菌采集动物抗凝全血（不宜用肝素作抗凝剂），死胎或活产马驹的脑、心、肺、肝、肾、脾和淋巴结等组织，公马可采集精液。采集的样品应立即放入冰盒中，尽快运送到实验室。如果不能及时送往实验室，组织样品冷冻于一20℃以下保存（抗凝全血样品4℃保存）。5.3.2样品处理
5.3.2.1全血样品的处理：取抗凝血加入2倍～3倍体积红细胞裂解液，混匀静止4min～5min，待红细胞完全破碎，1500r/min离心5min，弃上清液除去破碎的红细胞，得到白细胞沉淀（若仍有红细胞，则重复上述步骤，直到红细胞除尽）。加人PBS缓冲液，制成白细胞悬液，反复冻融两次，低温（一20℃）保存备用。
5.3.2.2动物组织样品的处理：无菌处理样品，样品称量，置于无菌容器内，加人少量维持液，用灭菌研研磨，制备成组织悬液。再加培养液，制成终浓度为10%的组织悬液。以2000r/min离心10min，收取上清液低温（一20℃）保存备用。5.3.2.3动物精液的处理：将精液超声波裂解三次（300w），每次15s；然后在4℃下2000r/min离心10min，沉淀精子细胞，取上清液低温（一20℃）保存备用。5.4病毒分离
5.4.1将上述上清液或细胞悬液用维持液作倍比稀释，无菌接种于已长成单层的RK-13细胞瓶或细胞培养板上，每个滴度接种两瓶或两孔。同时设立细胞对照和阳性对照，单层细胞仅加维持液作细胞对照，用60倍稀释的标准病毒接种作阳性对照。5.4.2加盖摇勾使之均匀分布于整个细胞层，置于5%二氧化碳培养箱中37℃吸附1h5.4.3加入含0.75%羧甲基纤维素的培养液，置于5%二氧化碳培养箱中37℃继续培养，每日在显微镜下观察细胞病变（CPE)情况（细胞圆缩、脱离、裂解）。5.4.4如果不出现CPE.应盲传2代～3代，即将细胞培养物冻融两次，再接种到单层细胞培养5d~7d后，用细胞染色液（工作液为0.1%福尔马林缓冲结晶紫溶液）染色。观察细胞单层是否细胞壁不完整的死细胞区域。
5.5结果判定
检查各种对照试验，细胞对照正常，无CPE；阳性对照出现明显的CPE，说明试验成立。如果试验2
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组出现明显的CPE，表现为细胞圆缩、脱落、裂解，则判为病毒分离阳性；如果没有明显的CPE，结晶紫染色后，细胞单层出现细胞壁不完整的死细胞区域，也判为病毒分离阳性。5.6病毒鉴定
用微量血清中和试验和荧光RT-PCR方法对分离的病毒进行鉴定。6微量血清中和试验
6.1仪器设备
生物安全柜、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、液氮贮存罐、高压灭菌锅、微量细胞培养板、微型振荡器、吸管（1mL、2mL、5mL、10mL）等。6.2试剂与材料
细胞培养液、细胞维持液、细胞消化液和抗生素贮存液等（试剂配制见附录A），标准阳性血清、阴性血清和被检血清经灭活备用（马血清56℃灭活30min，驴骤血清60℃灭活30min），RK-13细胞和马病毒性动脉炎病毒（EAV)Bucyrus株或其他参考毒株6.3操作方法
6.3.1中和病毒滴度（TCIDso）测定6.3.1.1中和病毒制备：将保存于液氮中的标准种毒EAVBucyrus株取出置于4℃缓慢融化，将融化的种毒用维持液作60倍稀释后，取1mL接种于长成单层RK-13细胞的细胞瓶中，37℃吸附1h。然后，先用维持液洗涤一次，再加人维持液，放置于37℃温箱中培养36h~48h，当50%～75%细胞出现CPE，即可收获病毒培养液，分装成1mL后冻存（一70℃以下）备用。6.3.1.2病毒滴度测定：在微量细胞培养板（96孔）每孔加25μL细胞培养液，用病毒稀释液将冻存病毒作10-1，10-210-\系列稀释，每一稀释度的病毒接种八孔，每孔25uL。正常细胞对照，四孔至八孔不加病毒，仅加25uL病毒稀释液。每孔100uLRK-13细胞（5×10*/100L），置37℃培养，48h后初判，72h终判。如细胞对照正常，接种病毒的细胞出现CPE（细胞圆缩、脱离、裂解），记录试验数据。根据Karber法计算该批病毒的毒价（半数组织感染量TCIDso）。6.3.2微量中和试验
6.3.2.1在96孔细胞培养板上每孔加25μL细胞培养液。第一列四孔作被检血清（毒性）对照，每孔加25被检血清，用移液器混匀后弃25L；第二列四孔，每孔加25L被检血清，混匀后吸出25u至第三孔·依次倍比稀释到第四孔，即血清稀释为1：2、1：4和1：8，每一稀释度各四孔。6.3.2.2用病毒稀释液将病毒稀释成工作浓度200TCIDso，第一列四孔加病毒稀释液（无病毒）作被检血清（毒性）对照，第二至四列的各孔加25L稀释的病毒。盖上培养板，轻轻摇匀，放入5%二氧化碳保湿培养箱37℃孵育1h。阴、阳性血清对照（方法同上）。6.3.2.3病毒滴度验证试验，将工作浓度的中和病毒再作10-1、10-2、10-3稀释，再加25μL病毒稀释液，每一稀释度各四孔。正常细胞对照，留四孔至八孔，每孔仅加25L的病毒稀释液，不加血清和病毒。上述每孔加100μLRK-13细胞，细胞浓度为（5×10*/100μL）。放入5%二氧化碳培养箱37℃培养，48h用倒置显微镜进行初步判定，72h后最终判定结果。6.4结果判定
6.4.1检查各种对照试验，细胞对照正常，无CPE；阴性血清出现明显的CPE，表现为细胞圆缩、脱落、TTKANYKAa
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裂解：阳性血清无CPE，细胞不出现病变。病毒滴度验证时滴度与原测定滴度相差应在0.31og10范围内，说明病毒稀释浓度符合微量血清中和试验的工作浓度。被检血清对照孔不出现病变，说明被检血清无毒性反应。
6.4.2在各种对照成立的情况下，检查各个被检血清的CPE。如果出现CPE比例大于50%，则判为阴性孔：如果CPE比例少于50%或不出现CPE，则判为阳性孔。以中和病毒感染性50%以上的最大稀释度为该血清的中和抗体效价。6.4.3被检血清孔1：4为阴性，判该动物为血清学阴性。被检血清1：4或更高稀释度的孔为阳性，判该动物为血清学阳性。被检血清孔1：2为阳性，或1：4孔出现的CPE不完全抑制（25%≤CPE≤50%)时，均判为可疑。出现可疑情况时，应对可疑血清重试一次，最终判定结果以重试为准。如果两次试验均为可疑反应，则该动物视为血清学阳性动物处理。7酶联免疫吸附试验（ELISA）
7.1仪器设备
酶标仪、96孔酶标板、单孔道和多孔道可调微量移液器（1uL、50μL、100uL、1000μL）、振荡培养箱等。
7.2试剂与材料
抗原、标准阳性血清、阴性血清、被检血清、PBS、包被缓冲液、封闭液、洗涤液、底物溶液、终止液、脱脂奶粉、H,O和酶标二抗等，试剂配制见附录B。7.3操作方法
7.3.1按照包被抗原所附说明书要求，用包被缓冲液稀释抗原，包被96孔酶标板，每孔100μL，置4℃过夜。
7.3.2倒掉孔内液体，在吸水纸上吸干，每孔加满洗涤液（PBS-T），静置1min～2min后倒掉，吸干，重复洗五次。
7.3.3加入封闭液，每孔100μL，置37℃振荡孵育90min，按7.3.2洗涤。置4℃冰箱备用。7.3.4被检血清用稀释液1：25稀释，每份血清加两孔，每孔100uL，每板均设标准阴、阳性血清（不需稀释）及稀释液对照各两孔，每孔100uL。加样完毕后放37℃振荡培养箱作用18h～24h。7.3.5按7.3.2洗涤。
7.3.6每孔加入用稀释液稀释至工作浓度的酶标二抗100uL，置37℃培养箱作用30min，按7.3.2洗涤。
每孔加入底物溶液100μL，置室温避光反应5min，从加第一孔开始计时7.3.8每孔加终止液100μL。在30min内测定OD值。7.4结果判定
判定标准：用酶标仪在波长450nm下测定OD值。当阳性对照OD值≥0.5，阴性对照OD值<0.2，试验成立，否则试验不成立，应重做。当样品OD值一阴性对照OD值>0.22.判为阳性。当样品OD值一阴性对照OD值<0.18，判为阴性。当0.18<样品OD值一阴性对照OD值<0.22之间时，判为可疑，应重复试验，若仍为可疑，则判为阳性。
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8荧光RT-PCR检测方法
8.1仪器设备
SN/T 1142—2011
荧光PCR检测仪、高速台式冷冻离心机、台式离心机、混匀器、冰箱（2℃～8℃和一20℃两种）、微量可调移液器（10μL、100μL、1000L）及配套吸头离心管（1.5m）。8.2试剂与材料
裂解液、三氯甲烷、异丙醇（一20℃预冷）、75%乙醇、DEPC水、引物、TagManone-stepRT-PCRMixReagents试剂盒等（参见附录C）。除特别说明外，所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器（用DEPC水处理后高压灭菌）分装。8.3操作方法
8.3.1样品处理
参考5.3.2。
8.3.2样本RNA的提取（按下述方法进行或采用等效的其他RNA提取试剂与方法进行）。8.3.2.1取n个（n=样本数十1管阴性对照十1管阳性对照）1.5mL灭菌离心管，作好标记8.3.2.2加人600uL裂解液，然后分别加人待测样本、阴性对照、阳性对照各200μL（每份样本换一个吸头），再加人200uL三氯甲烷，混匀器上振荡混勾5s（不宜过于强烈，以免产生乳化层；也可用手颠倒混匀）。于4℃12000r/min离心15min。8.3.2.3另外取n个1.5mL灭菌离心管.加人400μL异丙醇（一20℃预冷）作好标记。吸取上步骤各管中的上清液至少500μL（注意不要吸出中间层），加到相应的管中，颠倒混勾。于12000r/min离心15min，轻倒去上清液；然后将离心管倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品应在吸水纸的不同地方沾干）：加人60075%乙醇，颠倒洗涤。8.3.2.4于12000r/min离心15min，轻轻倒去上清液；然后将离心管倒置于吸水纸上，尽量沾干液体，不同样品应在吸水纸的不同地方沾干。8.3.2.54000r/min离心10s.将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干。每份样本换一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀的一面。室温干燥3min（不宜过于干燥，以免RNA不溶）。8.3.2.6加人20μLDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA。2000r/min离心5s，在冰上保存备用（注意：此时的RNA最易受RNA酶降解，请在2h内进行PCR扩增，若长期保存应放置在一70C）。8.3.3检测
8.3.3.1扩增试剂的准备与加样
从试剂盒中取出相应的各种试剂，在室温下融化后，2000r/min离心5s。每个样品测试反应体系配制见表1。
表1荧光RT-PCR反应体系
2XMasterMix
40XRnase Inhibitor
5pmol/μL引物
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10pmol/μL探针
RNA模板
DEPC水
表1（续）
将上述扩增试剂加入到96孔反应板中，盖紧管盖，2000r/min离心30s。8.3.3.2荧光RT-PCR检测
将加好样的96孔反应板放入定量PCR仪中，记录样本摆放顺序。循环条件设置：
第一阶段：48℃30min；
第二阶段：95℃10min；
第三阶段：95℃15s.60℃1min，40个循环，荧光收集设置在第三阶段每次循环的退火延伸时进行。
试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。8.4
结果判定
结果分析条件设定
读取检测结果。阅值设定原则以阅值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整
8.4.2质控标准
阴性对照无Ct值并且无扩增曲线8.4.2.2
阳性对照的Ct值应≤32，并且出现特定的扩增曲线如阴性对照和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效结果描述及判定
无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无动脉炎病毒8.4.3.2
Ct值32，且出现典型的扩增曲线，表明样品中存在动脉炎病毒。8.4.3.3
有效原则
Ct值>32的样本建议重做。重做结果无Ct值为阴性，否则为阳性。6
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A.1抗生素贮存液
附录A
（规范性附录）
病毒分离和微量血清中和试验试剂的配制SN/T1142—2011
用灭菌三蒸水配成每毫升含10000IU青霉素和10mg链霉素的抗生素贮存液，用微孔滤膜（0.22μm）过滤除菌，分装成2mL/瓶，一20℃冻存备用。保存期不超过60d。A.2红细胞裂解液（Tris-NH4CI）称取3.735g氯化铵、三羟甲基氨基甲烷（Tris)1.3g加水溶解并定容至500mL。0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用，
A.3细胞消化液（0.02%EDTA）
EDTA（乙二胺四乙酸二钠）wwW.bzxz.Net
Na2HPO12H,0
加三蒸水至1000mL，充分溶解，分装成小瓶，115℃高压灭菌10min，4℃冷藏备用。保存期不超过90d。
A.4细胞培养液和细胞维持液
细胞培养液：含10%灭能的无菌胎牛血清(FBS)的EMEM培养基。细胞维持液：含2%灭能的无菌胎牛血清（FBS)的EMEM培养基。细胞培养液和细胞维持液均用微孔滤膜（0.22μm）过滤除菌，分装成小瓶，4℃保存备用。保存期不超过60d。使用时加1%抗生素贮存液（终浓度为每毫升EMEM培养基含100IU和100μg），并用7.5%碳酸氢钠溶液调pH值至7.0~7.2。A.55%结晶紫购存液
25g结晶紫粉溶解于475mL纯乙醇，再定容至500mL，过滤除去结晶。A.61%细胞染色液
5%结晶紫贮存液100mL、生理盐水（0.85%氯化钠）375mL、福尔马林（含40%甲醛）25mL混匀，分装成5mL一瓶，4℃保存备用。保存期不超过90d。7
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77.5%羧甲基纤维素
羧甲基纤维素粉7.5g溶解于100mL双蒸水，充分搅拌混匀，121℃高压15min，分装成5mL一瓶，4℃保存备用。保存期不超过30d。oo
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包被缓冲液
溶解后置于4℃冰箱
磷酸盐缓冲液（PBS)
NazHPO4 ·12H,O 2.90 g
KH,PO4
附录B
（规范性附录）
ELISA试验试剂的配制
先加适量的双蒸水，完全溶解后加双蒸水定容至1000mL.pH为7.4。洗涤液（PBS-T)
PBS1000mL，吐温-20（Tween-20)0.5mL，混匀B.4封闭液
PBS1000mL，加5mL鸡血清和5g脱脂奶粉，溶解混匀。底物溶液
SN/T1142—2011
称取柠檬酸（CH.O，·H.O)10.5g，先加适量的双蒸水，完全溶解后加入双蒸水定容至B.5.1
1000mL.配成0.05mol/L柠檬酸溶液B.5.2称取10mg3.35,5-四甲基联苯胺（TMB）溶于2mLDMSO中，取200μL溶液加人到10mL0.05mol/L柠檬酸缓冲液（pH5.0)中，用前再加入2μL30%（体积分数）H,O.，即成底物溶液。B.6
6终止液：2mol/L硫酸
浓硫酸
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附录C
（资料性附录）
荧光RT-PCR试剂
C.1TaqManone-stepRT-PCRMixReagents试剂盒组成2xMasterMix
40xRnaseInhibitor
P1:5'-ATTGCAGAGCCTGGAGACCTTA-3'P2:5'-CCAACTGACGGTGTACGTGAGT-3\C.3探针
双标记探针的5端标记报告基因FAM羧基荧光素），3’端标记率灭基团TAMRA（羧基四甲基罗丹明）.其序列为：5-FAM-TAAATCAACAGGAGCGCGC-TAMRA-3。10
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