【行业标准】 牛生殖道弯曲杆菌病检疫技术规范

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1086—2011
代替SN/T1086—2002
牛生殖道弯曲杆菌病检疫技术规范Quarantine protocol for bovine genital campylobacteriosis2011-05-31发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-12-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1086—2002《胎儿弯杆菌的分离鉴定方法》。本标准与SN/T1086—2002相比，主要技术变化如下：修改了标准名称；
增加了间接荧光抗体检测方法和PCR检测方法。SN/T 1086—2011
本标准参考了世界动物卫生组织（OIE）《陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、禽鸟与蜜蜂）》(2009版)(Manual of DiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals2009)第2.4.5章内容。主要修改如下：
本标准采用了OIE规定的病原分离鉴定方法、间接荧光抗体检测方法、PCR检测方法；本标准删除了OIE中提到ELISA方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：侯艳梅、郭福生、秦贞奎、霍蕾、栾慎顺。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1086—2002。
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1范围
牛生殖道弯曲杆菌病检疫技术规范本标准规定了牛生殖道弯曲杆菌病的检疫技术要求。SN/T 1086—2011
本标准适用于牛生殖道弯曲杆菌病病原的分离鉴定，可用于该病的检疫、诊断和流行病学调查，规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语
TEM:增菌运输培养基
CH：半胱氨酸牛心浸膏培养基
MH:MullerHinton琼脂培养基
4设备和材料
4.1混合气体（质量比为3.5%O2、10%CO2、86.5%N，）。4.2厌氧培养罐。
4.3采样棒及吸球。
4.4凝胶成像系统。
培养基和试剂
见附录A。实验用水应符合GB/T6682的要求。6
病原分离与鉴定
6.1样品采集
6.1.1公牛包皮垢及精液
消毒清洗公牛尿道口后，将采样棒的采样端插入阴筒内，将另一端的吸球压扁并来回抽动，吸取包皮液，取出采样棒迅速插入盛有3mLPBS液的小瓶中吹吸数次后，立即封口。包皮冲洗时，用20mL～30mLPBS液注人包皮囊内，用力摩擦15s～20s后，将注人液体收集到无菌瓶内，立即封口；包皮垢亦可在采精后从假阴道中收集，即用20mL～30mLPBS液冲洗假阴道获得。
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精液应在无菌条件下采集，采集的精液装入无菌瓶内，立即封口。6.1.2母牛阴道粘液
消毒清洗阴门区后，将采样棒的采样端插入阴道，将另一端的吸球压扁并来回抽动，吸取阴道粘液，取出采样棒迅速插入盛有3mLPBS液的小瓶中吹吸数次后，立即封口；也可用无菌注射器连接一根无菌导管将20mL~30mLPBS液注人阴道腔内，来回抽动冲洗4次~5次，然后将液体收集到无菌瓶内，立即封口；阴道腔冲洗液亦可采用将无菌PBS液注入阴道腔内5min～10min后塞人无菌纱布块吸取的方法而收集。
6.1.3流产胎儿、胎盘
当有临床症状（参见附录B发生流产时，在无菌条件下采集胎盘、胎儿胃内容物、肝及肺等。采集后直接放入运输增菌培养基中，或者放人含1%福尔马林的PBS中，用于进行免疫荧光测定6.1.4样品镜检
样品同时涂片做革兰氏染色镜检。6.2样品运输
样品采集后，应4℃～8℃保存，并在48h内送至实验室；或将样品液静置1min~2min后，用灭菌注射器吸取2mL上清液，分别注入两瓶TEM中，每瓶1mL，振荡混匀，48h内送至实验室。6.3样品处理
6.3.1生殖道粘液处理
如果不是很粘稠，可以直接接种，或用等体积PBS液稀释后接种；如果很粘稠则需要加人等体积的半胱氨酸处理液（100mL水中加人0.25g盐酸半胱氨酸，调pH7.2后，用滤膜除菌使用），15min~20min后可用于接种。
6.3.2包皮或阴道冲洗液处理
3500g离心浓缩至250μL接种。
6.3.3胎儿胃内容物及胎儿内脏或组织处理胎儿胃内容物可直接接种；胎儿内脏或组织则先用火焰作表面灭菌并用组织匀浆机匀浆后接种。6.3.4胎盘膜处理
胎盘膜用PBS冲洗后，去除表面污染物，刮取绒膜、绒毛接种。以上处理液接种到增菌运输培养基上。6.4胎儿弯曲杆菌的分离培养
6.4.1将已接种样品的增菌运输培养基，置37℃培养72h，取出振荡并无菌操作，用接种环分别取环，划线接种于两个MH或CH琼脂平板培养基上，将培养基放置于厌氧培养罐中，充人混合气体，37℃培养72h。
6.4.2观察MH、CH培养基上有无胎儿弯曲杆菌的可疑菌落，如果没有，该样品胎儿弯曲杆菌为阴性。如果有，则将典型或可疑菌落划线于MH或CH琼脂平板培养基进行纯培养，方法同6.4.1。胎儿2
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弯曲杆菌在MH或CH琼脂平板培养基上的菌落特征为：不溶血、半透明、光滑、周边整齐、圆整、直径为1mm3mm左右
6.5胎儿弯曲杆菌的鉴定
6.5.1筛选试验
6.5.1.1取典型或可疑菌落纯培养物做革兰氏染色、运动力观察、氧化酶试验及触酶试验。胎儿弯曲杆菌为革兰氏阴性杆菌，呈螺旋转或“S”状，一些老龄培养物可出现球状或球杆状，不形成芽孢和荚膜，在菌体的一端或两端有鞭毛，呈特征性快速螺旋状穿梭运动。6.5.1.2纯培养平板用后应尽快放回混合气体环境，备进一步做生化试验和荧光抗体试验用。6.5.2生化试验
6.5.2.1取典型或可疑菌落纯培养物按表1进行生化试验。所有生化试验管均置于混合气体环境中，37℃培养3d。带胶盖的螺旋管，培养时应将试管盖放松。
胎儿弯曲杆菌生化反应
硫化氢
胎儿弯曲
杆菌胎儿
胎儿弯曲
杆菌性病
过氧化氧
酶实验
注：“+”
阳性反应：“一”
生长实验
甘氨酸
阴性反应：\d\
1%胆汁
氯化钠
反应不定：“R”
药敏实验
萘啶酮酸
30μg/片
拮抗：\s\
头孢霉素
30μg/片
敏感。
马尿酸
钠水解
氧化醇
6.5.2.2生长试验：取典型或可疑菌落纯培养物接种到2管巯基乙酸肉汤中，分别置于43℃和25℃温箱培养72h观察结果。如果肉汤上层出现雾状浑浊，说明细菌已生长。6.5.2.3硫化氢（H,S)试验：取典型或可疑菌落纯培养物接种于巯基乙酸肉汤中，试管口悬吊一条长×宽为20mm×6mm的乙酸铅滤纸，观察3d~4d，如见滤纸变黑即为产生HS。6.5.2.4甘氨酸、氯化钠、胆汁生长试验：取典型或可疑菌落纯培养物分别接种于含1%甘氢酸、3.5%氯化钠、1%胆汁的筑基乙酸肉汤中，37℃培养72h，如果肉汤上层出现雾状浑浊，说明细菌已生长6.5.2.5药物敏感试验：用铂金耳挑取典型或可疑菌落的纯培养物，置于1mL灭菌生理盐水试管中，制成浓度约为10%个/mL的菌液，将菌液涂布于MH琼脂平板上，然后用镊子把含有30μg萘啶酮酸和头孢霉素的滤纸片贴在MH血平板上，于混合气体37℃培养48h～72h，在药敏纸片周围产生3mm以上抑菌区为敏感。
6.5.2.6马尿酸钠水解试验：取典型或可疑菌落纯培养物接种于0.4mL1%马尿酸钠液中制成菌悬液，35℃37℃水浴2h，加人0.2mL节三酮试剂，混匀后水浴20min观察结果。变深紫色为阳性，淡紫色或不变色为阴性。同时可用18h～24h变形杆菌培养物作为阳性对照。3
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6.5.3结果判定
凡符合胎儿弯曲杆菌一般特征和生化特征的菌，均判定为胎儿弯曲杆菌阳性。过氧化氢酶试验、H，S试验、1%胆汁生长试验、3.5%氯化钠生长试验和马尿酸水解试验，其中任何一项不符合胎儿弯曲杆菌特性的，则判定为胎儿弯曲杆菌阴性。7间接免疫荧光试验
7.1制备免疫血清
将标准的胎儿弯曲杆菌菌株（胎儿弯曲杆菌性病亚种或胎儿弯曲杆菌胎儿亚种）接种到MH或CH琼脂平板培养基（含10%绵羊血）上，37℃混合气体培养3d，将菌体收获到PBS液中，离心洗涤两次。将胎儿弯曲杆菌悬浮于PBS液中，制成浓度为10=个/mL的菌悬液，加人弗氏不完全佐剂后，肌肉注射3月龄免子，每只2mL，分4个注射点，每个注射点接种0.5mL。接种前及接种后每隔一周采血一次，当血清滴度达到10°或以上时（用胎儿弯曲杆菌血清凝集试验或免疫荧光试验），再静脉注射0.1mL~1.0mL浓度为101\个/mL的菌悬液，7d后采血，将不同免子的血清混合在一起，作为免疫血清。7.2确定工作稀释度
用标准胎儿弯曲杆菌培养物涂片检测PBS稀释的不同浓度的免疫血清，确定工作稀释度。与待检菌产生明显荧光的最低浓度的2倍，即为工作稀释度。7.3酶标记抗体
选用商品羊抗免辣根过氧化物酶标记抗体，按说明书给出的工作浓度使用。7.4样品制备
生殖道液体样品（包括胎儿胃内容物、包皮垢冲洗液和阴道粘液）加入5mL1%福尔马林PBS液，2次离心。先在4℃600g离心10min，取上清液，再在4℃8000g离心30min，保留100μL上清液，将沉积物溶其中、作为被检样品。7.5间接免疫荧光试验
取20μL7.4制备的样品涂布在玻片上。用丙酮经一20℃30min固定，或者用乙醇经18℃~25℃30min固定，风干玻片后.加入工作浓度的免疫血清，在湿盒中37℃感作30min，用PBS液冲洗玻片3次。再加人羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体，湿盒中37℃避光感作30min。用PBS液冲洗玻片3次每次10min。最后用甘油缓冲剂（90%甘油：10%PBS)封固玻片。盖上盖玻片以防干燥，用荧光显微镜观察。同时用胎儿弯曲杆菌属作为阳性对照，其他弯曲杆菌属作为阴性对照。7.6结果判断
产生荧光并且有胎儿弯曲杆菌属典型菌体形态的，判定为胎儿弯曲杆菌阳性（见附录C)本荧光试验可以用来鉴定从样品中分离出的胎儿弯曲杆菌菌株，但不能用于菌株亚种的鉴别。8PCR法
8.1病料处理
按照7.4方法制备被检样品。
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8.2DNA提取
使用DNA快速抽提纯化试剂盒抽提基因组DNA8.3PCR试验
8.3.1引物
用于鉴定牛胎儿弯曲杆菌胎儿亚种的引物对：qh3F
5'-GGTAGCCGCAGCTGCTAAGAT-3\5-TAGCATCAATAACGACAACT-3\
用于鉴定牛胎儿弯曲杆菌性病亚种的引物对：qhVenSF
qhVenSR
5'-CTTAGCAGTTTGCGATATTGCCATT-3\5'-GCTTTTGAGATAACAATAAGAGCTT-3\8.3.2
PCR反应体系
应用50μL反应体系进行反应。在PCR管中，依次加人以下试剂：模板DNA
上游引物（25pmol/L）
下游引物（25pmol/L）
dNTP(2.5mmol/L)
TaqDNA聚合酶（2.5U/μL）1μL10XPCR缓冲液
8.3.3PCR反应条件
8.3.3.1鉴定牛胎儿弯曲杆菌胎儿亚种：SN/T 1086—2011
95℃预变性5min；95℃/30s，58℃/30s.72℃/60s，运行35个循环；72℃/10min；4℃，保存。8.3.3.2鉴定牛胎儿弯曲杆菌性病亚种：95℃预变性5min；95℃/30s，58℃/30s.72℃/30s，运行35个循环；72℃/10min；4℃.保存。8.4PCR产物的检测
8.4.1制备1%琼脂糖凝胶，
8.4.2加载样品：取10μLPCR扩增产物与5μL10X加样缓冲液混合，DNAMarkerDL2000相对分子质量标准5μL，加人凝胶孔中电泳。100V恒压电泳，凝胶成像系统观察电泳结果。8.5结果判定
PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外凝胶成像系统下观察结果：a）：当扩增出764bp大小的条带，并经测序与胎儿弯曲杆菌胎儿亚种PCR产物序列（参见D.1)相符，即判定为牛胎儿弯曲杆菌胎儿亚种阳性；b)
当扩增出141bp小的条带，并经测序与胎儿弯曲杆菌性病亚种PCR产物序列（参见D.2）相符，即判定为牛胎儿弯曲杆菌性病亚种阳性5
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附录A
（规范性附录）
培养基和试剂的配制
A，1增菌运输培养基（TransportEnrichmentMedium，TEM）成牛血清
5-氟脲嘧啶
放线菌酮
萘啶酮酸
多粘菌素B
1%煌绿
1000mL
1000000IU
将各种成分无菌操作加入到成牛血清中，充分混合后分装于20mL带胶皮塞（能密闭）的玻璃瓶中每瓶8mL，然后水浴或在蒸汽中加热2min3min（无压力），使血清凝固，冷却后用灭菌玻璃棒将血清凝块捣碎。最后无菌操作充入混合气体（3.5%O2，10%CO2，86.5%N，）。将制备好的TEM培养基保存在4℃冰箱中，可使用4个月。A.2
CH培养基（cysteineheartbloofagar）（含抗生素）牛心浸液（或牛心粉30g）
胰蛋白陈
右旋糖
氯化钠
L-半胱氨酸
蒸馏水
pH6.9~7.0
1000mL
加热溶解各成分后，115℃高压灭菌15min，冷却至50℃～55℃时，无菌加人：多粘菌素B
新生霉素
放线菌酮
绵羊血
混匀，倾注平板。放4℃冰箱保存备用。A.3MH培养基（MuellerHintonAgar）（含抗生素）牛肉浸膏
酪蛋白水解物
蒸馏水
1000mL
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pH7.4±0.2
各成分加热溶解，115℃高压灭菌15min，冷却至50℃～55℃时，无菌加入：放线酶酮
多粘菌素B
新生酶素
绵羊血
混匀，倾注平板。4℃冰箱保存备用。A.4巯基乙酸盐肉汤
L-胱氨酸
氯化钠
右旋糖
酵母浸膏
酪蛋白胰消化物（PancreaticDigestofCasein）巯基乙酸钠
蒸馏水
10000U
50mL~100mL
1000mL
SN/T1086—2011
加热至溶解，调节pH7.2±0.2，分装于试管中，每管5mL，115℃高压灭菌15min，4℃冰箱保存备用。
5氧化酶试剂
1%盐酸二甲苯对苯二胺水溶液，置棕色瓶中现用现配，一10℃保存，有效期1周。用于氧化酶试验。
3%过氧化氢（H202）
30%H,02
蒸馏水
装于棕色瓶中，有效期为1周。
用于触酶试验。
马尿酸盐水解试验
1%马尿酸钠
马尿酸钠
蒸馏水
A.7.2水合三酮
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PBS溶液
A.8.1A液：0.2mol磷酸二氢钠水溶液NaH,PO4·H,O27.6g，溶于蒸馏水中，最后定容至1000mL。A.8.2B液：0.2M磷酸氢二钠水溶液NaHPO·7H,053.6g.(或NaHPO,.12H,071.6g或Na,HPO,·2H,035.6g)加蒸
馏水溶解，最后定容至1000mlL。A.8.30.01mol磷酸盐缓冲溶液（pH7.2）0.2molA液
0.2molB液
氯化钠
用蒸馏水定容至1000mL。
经121℃15min高压灭菌，冷却后分装，4℃备用，91%琼脂糖凝胶
琼脂糖
1XTBE电泳缓冲液
熔化后加入5μL10mg/mL
EB贮存液，使凝胶中EB终浓度达到0.5μg/mL。TBE电泳缓冲液（5倍浓缩液）
去离子水
1000mL
用5mol/L的盐酸调到pH8.0。
使用时用去离子水稀释至1倍的TBE电泳缓冲液。A.11
10×加样缓冲液
含0.25%溴酚蓝和40%蔗糖的水溶液o0
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附录B
（资料性附录）
疾病简介
SN/T 1086—2011
牛生殖道弯曲杆菌病是由专嗜牛生殖系统的胎儿弯曲杆菌引起的。胎儿弯曲杆菌包括胎儿和性病两个亚种，为革兰氏阴性杆菌，具有一端或两端鞭毛结构，不形成芽孢，一般不形成荚膜，有动力，呈“S”状或螺旋状弯曲。其生化特性为不发酵碳水化合物、氧化酶试验阳性、还原硝酸盐、不分解尿素、不液化明胶，V-P、MR试验阴性，对1%牛胆汁有耐受性，DNAG十C比例是30～50。本菌微需氧，在含有3.5%O2、10%CO2、86.5%N2的混合气体环境中生长良好，在10%绵羊血CH琼脂平板培养基上纯培养形成淡灰色半透明的薄面纱样菌落。最适生长温度为37℃，在42℃不生长。对链霉素、氯霉素、四环素、红霉素敏感，而对青霉素、杆菌肽、多粘菌素B、新生霉素、三甲氧芊氨嘧（TMP）有抵抗力。病原菌主要通过自然交配传播，慢性带菌公牛精液中存在胎儿弯曲杆菌性病亚种，经人工授精可造成该疾病扩大蔓延的危险。胎儿弯曲杆菌胎儿亚种通常在牛的肠道可分离到，与性病亚种相比较，其致病性较弱，但可引起牛散发性流产，试验感染青年母牛，病原持续存在几周、十几个月甚至更长。牛生殖道弯曲杆菌病的诊断主要依据从公牛、母牛或流产胎儿体内取样，做病原分离鉴定、PCR实验或根据其特异性免疫反应而确诊。
SN/T1086—2011
附录C
（规范性附录）免费标准bzxz.net
胎儿弯曲杆菌形态图
图C.1免疫荧光抗体染色胎儿弯曲杆菌形态图
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