【行业标准】 Q热检疫技术规范

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1087—2011
代替SN/T1087-2002
Q热检疫技术规范
QuarantineprotocolforQfever
2011-05-31发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
数码效您
2011-12-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1087—2002《牛Q热微量补体结合试验操作规程》。本标准与SN/T1087一2002相比，主要技术变化如下：增加了病原分离和鉴定；
增加了间接免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验方法。SN/T1087—2011
本标准同等采用世界动物卫生组织（OIE）《ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals》(2008版）中第2.1.12章Q热部分。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准土要起草人：鄂志强、柯忠哲、马保华、鱼海琼、林志雄、李贺、林宝珍、陈升毅、昌平、刘计亮、朱来华。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1087—2002。
1范围
Q热检疫技术规范
SN/T1087—2011
本标准规定了Q热的检疫规范，包括病原分离鉴定、血清学试验，其中血清学试验包括酶联免疫吸附试验、间接免疫荧光试验和补体结合试验。本标准适用于进出境牛、羊等易感动物Q热的检疫和诊断。2缩略语
下列缩略语适用于本文件，
QFever:Q热
C.Burnetii：伯纳特柯克斯体
ELISA：酶联免疫吸附试验
IFA：间接免疫荧光试验
HEL：人胚肺成纤维细胞
CPE：细胞致病效应
PBS:磷酸盐缓冲液
FITC：异硫氰酸荧光素
RNA:核糖核酸
OPD：邻苯二胺
OD值：光密度值
VBD：巴比妥钙镁缓冲液
LPS:脂多糖
3临床症状
Q热临床症状及其他信息参见附录A。4
检疫方法
病原分离和鉴定
4.1.1材料准备
器材：荧光显微镜、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、25cm细胞培养瓶、24孔平底细胞培养板、4. 1. 1. 1
带盖湿盒、组织捣碎机、冷冻离心机。4.1.1.2试剂：
4.1.1.2.1无c.Burnetii抗体续牛血清。4.1.1.2.2人胚肺成纤维细胞（HEL)。SN/T1087-2011
4. 1. 1. 2.3
C.Burnetii标准菌株和标准阳性、阴性血清、C.Burnetii荧光抗体。4.1.1.2.4溶液及细胞培养液：见附录B。4.1.1.31日龄～2日龄豚鼠。
链霉素、庆大霉素。
5样品：胎盘子叶、肺、肝、流产胎儿皱胃内容物；母畜阴道分泌物、奶样、粪便。4.1.2样品的处理
将样品剪碎，在组织捣碎机内捣碎，用含抗生素（链霉素100μg/ml200g/ml.和庆大聋紊50μg/mL～100μg/mL)的PBS磷酸盐缓冲液制成组织悬液，于4℃作用4h3000r/min离心后.保留上清液。
4.1.3病原分离
对无污染的样品，按常规方法培养HEL单层细胞，倒去培养液，接种样品组织上清液.每样接种3瓶、每瓶接种1mL。于37℃吸附2h后加细胞维持液，封闭、置37℃二氧化碳箱培养，24h后逐日在例置显微镜下观察细胞病变，连续观察21dC.Burneti特征性CPE（细胞致病效应）：HEI.细胞空泡化。无CPE的盲传2代。如有CPE，则待70%细胞出现CPE时收毒，将细胞反复冻醛2次，3000r/min离心20min，取上清液4℃保存待鉴定。
4.1.4培养物的鉴定
4.1.4.1将生长良好的细胞，用细胞分散液处理后，制备成2X10°/mL的细胞悉液.加入到24孔细胞培养板内，每孔3mL，封闭、置37℃二氧化碳培养箱培养。4.1.4.2等细胞生长成80%的单层，吸出孔内培养液，接种4.1.3待鉴定上清液.每孔3ml.每个样品2个孔，另外4.1.3上清液用适量C.Burnetii阳性血清中和后接种2个孔，每孔3mL：阴性、阳性和空白细胞对照方法同待检样品培养物，每个对照2个孔。4.1.4.3置37℃二氧化碳培养箱吸附2h。4.1.4.4吸出各孔内所加的待检和对照样品，加人维持液，每孔3mL，封闭、置37℃二氧化碳培养箱培养10 d。
4.1.4.5取出细胞板，PBS漂洗，自然干燥后，用一20℃预冷的丙酮固定30min，用PBS洗3次，每次5min，白然干燥。
4.1.4.6滴加适量C.Burnetti阳性血清，置37℃作用1h。4.1.4.7滴加适量C.Burnetii免疫荧光抗体（二抗），放进湿盒，37℃作用2h。4.1.4.8用PBS洗3次，倾去液体。4.1.4.9荧光显微镜镜检。
4.1.5结果判定
阳性对照在显微镜下胞浆呈黄绿色，并见有黄绿色荧光的细小颗粒散布于胞浆内。阴性对照、空白对照无荧光。
没有经过阳性抗体作用的细胞荧光较亮，形态清晰，而经过阳性抗体抑制的同一样品无荧光.则判为阳性。
没有经过阳性抗体作用的细胞荧光微弱，形态不清断晰，经过阳性抗体抑制的同一样品无荧光，则重检；重检后仍荧光微弱，形态不清晰，则判为阳性，重检后无荧光则判为阴性。2
SN/T 1087—2011
如果阳性对照无特异性荧光或阴性对照出现特异性荧光，则试验失败，应该重检。4.2间接免疫荧光试验（IFA）
4.2.1材料准备
4.2.1.1器材
荧光显微镜、保湿培养箱、冲洗盆.微量移液器等。4.2.1.2试剂
4.2.1.2.1IFA抗原平板诊断板的制备：见附录B。4.2.1.2.2FITC标记的免抗牛（羊）IgG：使用时用含0.01%伊文思蓝的样品稀释液稀释至工作浓度。4.2.1.2.3PBS、甘油缓冲液、1%伊文思蓝染色液、C.Burnetii阴性和阳性对照血清。3样品
采集待检动物血液.分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌的2mL离心管内、4℃或一20℃冰箱保存或立即送检，试验前将待检血清统一编号。4.2.2
操作方法
待检血清灭能30min（牛：56℃～57℃；绵羊、山羊：63℃），然后用PBS作1/40～1/640倍4.2.2.1
比稀释。
取出事先准备好的抗原诊断板，置室温预温，不要触摸板孔。4.2.2.21
4.2.2.3每孔滴加20μL稀释度不同的血清，同时做阴性和阳性血清对照，其中一孔，滴加20μLPBS作为抗原对照。
4.2.2.4置保湿培养箱37℃30min。反应板用PBS冲洗两次，每次10min。用PBS洗涤，风干。4.2.2.5每孔（包括对照孔）滴加工作浓度的FITC标记的免抗牛（羊）gG20μL，于37C保湿培养箱中孵育30min。用PBS洗涤三次，风干后立即用荧光显微镜观察。4.2.3结果判定
阳性血清对照孔出现规则形状的特异性强绿色荧光信号，阴性血清对照孔及抗原对照孔无特异性绿色荧光信号，则试验成立，可进行结果判定。待检血清在1/160及更高稀释时，有形状规则的特异性绿色荧光信号时，可判定为阳性。待检血清在1/160及更高稀释时，没有形状规则的特异性绿色荧光信号时，可判定为阴性。4.3酶联免疫吸附试验（ELISA)
4.3.1材料准备
4.3.1.1器材
酶标仪、微量酶标反应板、37℃培养箱、保湿盒、冰箱、8道或12道微量移液器、微量板振荡器、洗板机等。
4.3.1.2试剂
C.Burnetii全细胞灭活抗原、酶标结合物、十倍浓度的稀释液（吐温/PBS液）、洗涤液、封闭液、双3
SN/T1087—2011
蒸水、四甲基联苯胺(TMB)、双氧水、终止液、阳性及阴性对照血清。4.3.1.3样品
采集待检动物血液，分离血清.血清应新鲜、透明、不溶血、无污染.密装于灭苗2mL离心管.4℃或一20℃冰箱保存或立即送检，试验前将待检血清统一编号。4.3.2操作方法
4.3.2.1包被抗原：取96孔平底微量反应板，于各孔加工作浓度的全细胞灭活抗原100L.封板.置保湿盒内放37℃培养箱中感作60min，再放置4℃冰箱内过夜。4.3.2.2洗板：弃去板中包被液，加洗涤液洗板，每孔300μL，洗涤三次，每次1min.在吸水纸上轻拍干。
封闭：每孔加人封闭液100μL，封板后置室温感作30min～90min。洗板：方法同4.3.2.2。
将血清样品包括对照血清稀释至适当浓度（通带为1/100)，每孔滴加100μL，每个样品加2个孔。对照血清包括阴性、阳性血清。4.3.2.6
盖上微量板，置室温感作30min~洗板：方法同4.3.2.2。
90min。
将酶标结合物稀释至工作浓度，每孔滴加100盖上微量板，置室温感作3P
min~90min。
洗板：方法同4.3.2.2。
每孔加100LTMB底物溶液，根据产品说明，感作说明书上规定的时间。加终止液100μL终止氧化物酶反应。用酶标仪在波长450nm下测定OD值，这医些OD值将用于计算结果。
4.3.3结果判定
对于商用试剂盒，可根据其提供的值和解释判定一般情况下，计算待测血清以本阳性和阴性对照血潜的平均吸光值[待检血清平均OD值（Ab）、旧性血清平均OD值（Abpos）和阴性血清平均OD值(Abmm）门。按式(1)计每份血清的百分比P(%)：p
结果判定如下：
P<30%：判为阴性血清。
(AbAbg）/（AbAb）×100%
**(1 )
P在30%~～40%之间：判为可疑血清，对于可疑血清，需要重新检验，如重新检验结果仍为30%~40%之间，则判定为阳性血清。
P>40%：判为阳性血清。
4.4补体结合试验(CF)
材料准备
4. 4. 1.1
96孔U型底反应板、微量板振荡器、37℃培养箱、水浴锅、8道或12道微量移液器、离心机。4.4.1.2试剂
pH7.2巴比妥钙镁缓冲液（VBD)、绵羊红细胞、溶血索、C.Burneti抗原、补体、阳性和阴性对照4
血清。
4.4.1.3样品
SN/T1087—2011
采集待检动物血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或一20℃冰箱保存或立即送检，试验前将待检血清统一编号。4.4.2预备试验
4.4.2.1溶血素效价的测定
4.4.2.1.1溶血素的稀释：取溶血素0.1mL加VBD9.9mL混匀（如果是等量甘油保存的溶液，取溶血素0.2mL加VBD9.8mL)，制成t00-倍稀释的溶血素再用-VBD把已经100倍稀释的溶血素分别稀释成500、1000、1500、2000、250克、3000、4000、5000、6-000倍稀释的9种溶液。4.4.2.1.2补体的稀释：用VBD把补体分别稀释成30、40、50、60、70、80、90、100倍稀释的8种溶液。500~1：6000)的溶血素与等量的2%红细胞4.4.2.1.3致敏红细胞悬液的制各：将不同稀释度(1悬液混合，置37℃水浴15min，作为致敏红细胞。4.4.2.1.4溶血素效价的滴定：采用方阵法在微量板上滴定。如表1所示，1～9列为溶血索稀释度(1：500～1：6000），AH行为补体稀释疫（1：30～1.100）。吸取不同稀释度的致敏红细胞悬液50μL，分别滴加于1～9列的各孔中［吸取不同稀释度的补体50L分别滴于A-H行各孔中，每孔再加25μLVBD，滴加完毕后，置微量城荡器上混匀，随后置37℃温箱中感作30min后进行初判，置室温心5min或·4℃冰箱中过夜后进行终判。2h、水平转子离心机2000r/min离表1免费标准bzxz.net
溶血素效价滴定判定举例表
补体稀释比例
1 : 80
1 : 90
1:1000
溶血素稀释比例
1:15001:26001:25001:3000
注：++为50%溶血；+为75%溶血；一为100%溶血。+
1:4000
1:5000
1:6000
5溶血素效价的判读：对比标准溶血孔（见附录C)进行.在最小量的补体存在下，能使90%4.4.2. 1.5
红细胞发生溶血的最高稀释倍数为一个单位溶血素，测定补体效价和做本试验时用两个单位溶血素。如表1的测定结果为，补体在1：70稀释时，发生90%溶血的最少溶血素为1：4000，该1：4000为一个单位溶血素。两个单位溶血素为1：2000。4.4.2.2补体效价的测定
补体的稀释：用VBD把补体分别稀释成30、40、50、60、70、80、90、100倍稀释的8种溶液。4.4.2.2.12
SN/T1087—2011
4.4.2.2.2
使用两个单位溶血素，制备致敏红细胞悬液。4.4.2.2.3补体效价测定：在微量板上1～8列为1：30～1：100稀释的补体，各稀释度按表2中定量添加，再以VBD补充至每孔50μL；接着每孔滴加25μL的抗原后，再滴加50μl.2%致敏红细胞悬液，充分振荡混勾后，置37℃温箱中感作30min后进行初判，然后置室温2h、水平转子离心机2000r/min离心5min或置4℃冰箱中过夜后进行终判。表2
补体效价测定
补体体积
4.4.2.2.4
补体稀释比例
1 : 100
补体效价的判读：对比标准溶血孔（见附录C)进行，取30μL补体呈现90%溶血，20叫l补体呈现75%～90%溶血时补体的最高稀释度作为补体的效价。在正式试验时补体用量为25l.，如表3的测定结果，1：70的补体25叫L为-个单位补体，试验时用两个单位补体、则1：35补件25l.为再个单位补体。
表3补体效价判定举例表
补体体积
补体稀释比例
1 : 70
注：++++为0%溶血；+++为25%溶血；++为50%溶血；+为75%溶血；一为100%落立。4.4.2.3
抗原效价的确认或测定
1 : 100
根据供应单位的抗原说明书来决定是否需要进行抗原效价的测定。如不需测定，则在确认4.4.2.3.1
抗原效价后按说明稀释使用；如需测定，则按下列步骤进行。4. 4. 2. 3. 1.1
4. 4.2.3.1.2
4. 4. 2.3. 1. 3
4. 4. 2. 3. 1.4
用VBD将抗原依次作1：50、1：100、1：200、1：400稀释。用VBD将阳性血清依次作1：10、1：20、1：40、1：80稀释。标准阴性血清不作稀释。
按表4建立试验。
阳性血清
成分及稀释度
1 : 10/μL
1 ·20/μL
1 : 40/μL
1:80/μL
1:10阴性血清/μL
2单位补体/μL
VBD/μL
致敏红细胞/L
抗原测定表
抗原稀释度
血清对照
4℃感作12h～18h后置室温10min50
抗原对照
SN/T1087—2011
红细胞
补体对照
37℃感作30min后进行初判，然后置室温2h，水平转子离心机2000z/min离心5min，或4℃冰箱过夜后进行终判
4.4.2.3.1.5
抗原效价的判读：对比标准溶血孔（见附录C)进行，当血清对照孔、抗原对照孔、补体对照孔出现100%溶血，而红细胞对照孔不出现溶血且红细胞全部沉于孔底时判定抗原效价。以与阳性血清各稀释度发生完全抑制溶血的最高稀释度为一个单位抗原，正式试验使用2单位抗原。4.4.3正式试验
标准阳性血清和标准阴性血清使用前用VBD作1：10稀释，56℃水浴灭能30min；待检血清使用前用VBD作1：10稀释，灭能30min（牛：5G℃~57℃；绵羊、山羊：63℃）。按表5建立正式试验。表5
成分及稀释度
1:10待检血清/μL
1：10旧性血清/μL
1:10阴性血清/μL
2单位抗原/μL
2单位补体/μL
VBD/μL
致敏红细胞/μL
补体结合试验正式试验操作表
待检血清
试验孔
对照孔
阳性血清
阴性血清
4℃感作12h~18h后暨室温10min
抗原对照
补体对照
红细胞对照
37℃感作30min后进行初判，然后置室温2h，水平转子离心机2000t/min离心5min，或4℃冰箱过夜后进行终判
SN/T1087—2011
4.4.4结果判定
4.4.4.1先观察对照管结果。当阳性血清孔和红细胞对照孔出现100%抑制溶血.阴性血清对照孔抗原对照孔、补休对照孔及待检血清对照孔均出现100%溶血时判定待检血清结果。4.4.4.2对比标准溶血孔（见附录C)进行，对待检血清管进行判定，并作如下记录：++++表示90%以上抑制溶血；
+++表示75%以上抑制溶血；
+十表示50%以上抑制溶血；
十表示25%以上抑制溶血；
一表示100%溶血。
4.4.4.3判定标准：待检血清1：10痛释时小于50%抑制溶血为阴性。在进出境动物的检疫中，对判定标准有规定的按规定执行。
A.1Q热(QFever)
附录A
（资料性附录）
疾病概述
SN/T1087—2011
Q热是由伯纳特柯克斯体(C.Burnetii)引起的一种人畜共患病，人感染后表现急性和慢性两种病型，急性通常表现为自限性发热、肺炎、肉芽肿型肝炎；慢性型表现为病人瓣膜受损的心内膜炎，慢性型并发症病人若没有合适的抗生素治疗，会导致死亡，孕妇感梁后引起早产或胎儿生长缓慢，自发性流产或死亡。Q热对母牛、母羊和山羊能诱发流产以及早产、死亡、子宫炎和不育等繁殖紊乱。A.2病原
Q热病原体为伯纳特柯克斯体，为一种革兰氏阴性的专性细胞内寄生菌，能在吞噬细胞的吞噬溶酶体内旺盛生长，过去被分类为立克次氏体。然而基于-16SRNA序列的基因进化分析表明C.Burnetii与原菌门a亚门的立克次氏体属的亲缘关系较远。自前Burmnetn被分类为原菌门r亚门、军团菌目、柯克斯体属、柯克斯体科。最近，已完成了C.Burnetii的全基因组测序，证实其分类地位与立克次氏体不同，C.Burneti科形成小而致密的在环境中高度稳定的芽孢状体.这非常有利于其传播。这种特性使得C.Burnetii存在发育循环变异体：人细胞变异体(LCV)、小细胞变异体（SCV)和小浓缩体(SDC)。SDC和SCV是细胞外存活的感染性粒子。另一个特点是C.Buriretii具有2种抗原形式，致病性抗原I相，见于被感染的人和动物；非致病性抗原Ⅱ相，存在于卵内和体外培养。经鸡胚或细胞传代过程中，该菌发生脂多糖（LPS)变异：I相菌细胞具有全长APSO一链，体外传代变为截段的LPSO一链，成为Ⅱ相菌时则切除了LPS。这种LPS变异是由染色体的不可逆缺失所致细菌则不能从IⅡI相变回I相。由于该病原体抵抗力强、具有极大的危险性，因此操作活病原体应在符合OIE要求的3级生物安全实验室中进行。
A.3流行病学
Q热是一种人畜共患病。Q热感染主要是通过吸人干燥的气溶胶颗粒、接触感染动物及其生殖组织而传播。摄人感染主要是通过饮、食未经消毒处理的、基至经巴氏消毒的奶品。Q热在人间传播罕见，但接生时暴露、性接触和输血均可传播。动物可经消化道、呼吸道、垂直传播和性传播而感染，节肢动物主要是蜱蝴可传播Q热。病原可在动物体内持续感染，经奶、粪便、尿排出病原，有时血液带菌。病原大量存在于生殖排出物（胎盘、羊水和胎儿），未孕动物传播风险较少。家养反台动物被认为是主要的贮存宿主，但猫、犬、家免、鸟等也有报道带菌，均可导致人类感染。A.4临床症状
牛患Q热的症状有流产、死胎或弱特、胎衣不下、子宫内膜炎和不育。小反负兽患Q热常伴发畜群突然流产，紧接着无并发症康复，但感染则持续多年或终生。绵羊、山羊、牛主要呈无症状带菌，但在分娩时排出大量病原菌，并在分泌物和排泄物中间歇排菌。猫、免、鸟等家养动物均易感，是人与动物的可能传染源。
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