【行业标准】 动物结核病检疫技术规范

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1310—2011
代替SN/T1310—2003
动物结核病检疫技术规范
Quarantine protocolfor animal tuberculosis2011-05-31发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-12-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1310—2003《猴结核皮内变态反应操作规程》。本标准与SN/T1310—2003相比，主要技术变化如下：修改了标准的名称；
增加了细菌学检查方法；
一增加了实时荧光PCR方法；
-增加了常规PCR检测方法；
增加了其他动物结核皮内变态反应试验方法。SN/T1310—2011
本标准参考了世界动物卫生组织（OIE发布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2009版）中2.4.7章“Bovinetuberculosis\和2.3.6章\Aviantuberculosis”。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：陈茹、许如苏、田纯见、史夏玲、吴晓薇、曾碧健、苏世敏、罗长保、周科、鱼海琼、洪琼华、孙岩松。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1310—2003。
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1范围
动物结核病检疫技术规范
SN/T1310—2011
本标准规定了动物结核病的结核菌素皮内变态反应试验、细菌学检查、实时荧光聚合酶链式反应(PCR）和常规PCR检测方法的技术要求本标准适用于进出境牛、猪、猴、禽等动物结核病的检疫和诊断。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3
缩略语
下列缩略语适用手本文件。
PPD(purifiedproteinderivative）：提纯蛋白衍生物提纯结核菌素IU（internationalunits）：国际单位PCR（polymerasechainreaction）：聚合酶链式反应EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid)：乙二胺四乙酸PBS(phosphatebuffersolution）：磷酸盐缓冲液dNTP（deoxyribonucleosidetriphosphate）：脱氧核苷酸三磷酸Tag酶：TagDNA聚合酶
UDG（uracilDNAglycosylase）：尿嘧啶DNA糖基化酶DMSO(dimethylsulfoxide）：二甲基亚矾bp(basepair）：碱基对
生物安全要求
样品采集、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守GB19489的有关规定。5
结核菌素皮内变态反应试验
5.1器材
5.1.1弯剪。
5.1.2卡尺。
5.1.3注射器：可采用医用玻璃卡介苗注射器、皮试专用连续注射器或1mL一次性无菌注射器，针头规格为0.5mmX10mm。
5.1.4脱脂棉。
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5.2试剂
5.2.1灭菌生理盐水。
5.2.2牛型PPD：根据使用说明将原液用灭菌生理盐水或稀释用水稀释为使用浓度。PPD冻干粉稀释：在无菌状态下吸取一定量的灭菌生理盐水或稀释用水，注人冻干粉玻璃瓶中，充分摇匀后使用，应现配现用。
5.2.3禽型PPD：配制方法同5.2.2。5.2.4人型PPD：配制方法同5.2.2。5.2.575%酒精。
5.3牛结核皮内变态反应试验
5.3.1操作方法与结果判定
可单独采用牛型PPD,也可同时采用牛型PPD和禽型PPD进行试验。注射部位在颈侧中部上三分之一处或尾根部。3个月以内的牛也可在肩脚部进行。应确认注入皮内。
颈部术部剪毛，直径约10cm，用卡尺测量术部中央皮皱厚度，作好记录，术部应无病变。牛型和禽型PPD的注射部位应间隔开，在颈部同侧应间隔约12cm～15cm，或在不同侧进行。用75%酒精消毒注射部位.在皮内注人牛型PPD或离型PPD.剂量为牛型PPD每头0.1mL、不低于2000IU.或按试剂说明书配制的剂量；禽型PPD每头0.1mL、不低于2000IU.或按试剂说明书配制的剂量。注射后72h观察判定结果。仔细观察局部有无发热、肿胀等炎性反应，用卡尺测量皮皱厚度，注射前后同一部位的卡尺测量方向应保持一致。在记录表上作好详细记录。5.3.2单独采用牛型PPD
颈部注射。术部注射前后皮厚差大于或等于4mm，或出现典型炎性反应，判为阳性：皮厚差大于2mm并小于4mm，且无典型炎性反应判为可疑；皮厚差小于或等于2mm，无典型炎性反应，判为阴性。对于已确认感染的牛群，皮试出现任何可触摸或可见的肿胀反应均判为阳性。尾根部注射。出现反应判为阳性，未出现可触摸或可见的炎性反应判为阴性。5.3.3同时采用牛型PPD和禽型PPD注射牛型PPD部位的皮厚差大于注射禽型PPD部位的皮厚差4mm以上，或对牛型PPD反应为阳性（判定见5.3.2）、并且对牛型PPD的反应大于对禽型PPD的反应、两者皮厚差在2mm以上，判为牛型PPD皮内变态反应试验阳性；其他情况下，注射牛型PPD部位的皮厚差大于注射禽型PPD部位的皮厚差1mm～4mm，判为牛型PPD皮内变态反应试验可疑；注射牛型PPD部位的皮厚差与注射禽型PPD部位的皮厚差小于1mm，或注射牛型PPD部位的皮厚差小于或等于注射禽型PPD的部位，判为牛型PPD皮内变态反应试验阴性；对禽型PPD的反应大于对牛型PPD的反应，二者皮厚差在2mm以上，判为禽型PPD皮内变态反应试验阳性。5.3.4复检
判为可疑反应的，于42d后进行复检。结果仍为可疑或阳性的，判为阳性。5.4猴结核皮内变态反应试验
5.4.1操作方法
由助手对猴进行保定，使其两前肢向背后，用左手抓住猴头部后侧的皮毛，使之不得任意转动。注2
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射部位为上眼险。
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用75%酒精对上眼脸局部消毒，术者左手固定头部，右手持1mL注射器，针头斜面向上，与上眼脸平行，距睫毛约5mm皮内注射0.1mL牛型PPD或人型PPD,剂量为牛型PPD2000IU～2500IU，人型PPD4000IU，或按试剂说明书配制的剂量。注射后无异常反应，局部有扁豆粒大小的隆起。5.4.2结果判定
注射后48h、72h观察判定结果。仔细检查注射部位有无热、红、肿等炎性反应，并与对侧正常上眼脸进行对照。上眼脸发红，注射部位肿胀明显，判为阳性；上眼脸轻度发红，无肿胀，判为可疑；上眼脸无反应.判为阴性。
5.4.3复检
判为可疑反应的，于30d后在另一侧进行复检。结果仍为可疑或阳性的，判为阳性。5.5禽结核皮内变态反应试验
5.5.1操作方法
家禽可在肉翼皮内注射禽型PPD,剂量为每羽0.1mL约2000IU或按试剂说明书配制的剂量。5.5.2结果判定
注射后48h观察判定结果。注射部位肿胀，出现硬结、扩展至对侧肉髯和颈部的广泛性水肿等炎性反应，判为阳性；注射部位无肿胀等炎性反应，判为阴性。5.6猪结核皮内变态反应试验
5.6.1操作方法
采用牛型和禽型PPD,耳根部皮内注射。牛型PPD剂量为每头0.1mL、不低于2000IU.或按试剂说明书配制的剂量；禽型PPD剂量为每头0.1mL、不低于2000IU，或按试剂说明书配制的剂量。5.6.2结果判定
注射后72h观察判定结果。注射部位出现明显肿胀等炎性反应，判为阳性：注射部位无反应判为阴性。
5.7其他动物结核病皮内变态反应试验羊、鹿等其他大中动物的皮内变态反应试验参照牛的皮内变态反应试验进行。6细菌学检查
6.1设备
Ⅱ级生物安全柜，恒温培养箱，冰箱（2℃～8℃，一18℃），离心机（离心力可达2000g），显微镜6.2试剂
除特别规定，所用化学试剂为分析纯。溶液与培养基：4%硫酸，3%或4%氢氧化钠溶液，5%~10%盐酸溶液.氢氧化钠消化液，0.1mol/L柠檬酸钠溶液、安替福民（antiformin）溶液、甘油蛋白、-尼氏（Ziehl-Neelsen）抗酸染色液，对硝基苯甲TTKANYKAa
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酸（PNB）培养基、PBS（1/15mol/L）缓冲液、改良罗氏（Lowenstein-Jensen，L-J）培养基、吐温-8d(Tween-80)水解试验溶液、硝酸盐还原试验溶液、0.2%氨基苯磺胺、0.1%N-甲基盐酸二氨基乙烯、0.12%尿素溶液、0.1%酚红指示剂、噻盼-2-羧酸肼（TCH)培养基。配制方法见附录A。6.3病料的采集、运送与处理
6.3.1病料的采集
对手病、死动物，应采集其淋巴结及病变组织器官（如：肝、脾、肺等）作为细菌学检查的材料；对于怀疑有呼吸道结核、乳房结核、泌尿生殖道结核、肠结核的活畜，应相应采集其痰、乳、精液、子宫分泌物、尿和粪便作为细菌学检查的材料；对于皮内变态反应试验阳性，但尸检无病理学变化的动物，应采集其下颌、咽后、支气管、肺（特别是肺门及肺门淋巴结）、纵及一些肠系膜的淋巴结作为细菌学检查的材料6.3.2病料的运送
样品应封装在无菌的洁净容器或样品袋内冷藏运送。如当天无法送达实验室的，应予冷冻后运送。当无法提供冷冻条件时，可在病料中加人硼酸，使其终浓度为0.5%，但样品处理保存时间不超过1周。6.3.3病料的前处理
6.3.3.1硫酸处理法
此法适用于痰、尿、粪和病变组织等的处理。处理前，病变组织先按常规方法研磨或匀浆制成乳剂。用4%硫酸溶液将痰、尿、粪或病变组织等按1：5之比例加人混合·然后置37℃作用1h～2h，经1000g离心30min，弃上清液，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。也可用硫酸处理后，在沉淀物中滴加3%氢氧化钠溶液中和，然后涂片镜检、培养。6.3.3.2氢氧化钠处理法
此法适用于痰、尿、粪和病变组织等的处理。消化处理前，病变组织先按常规方法制成乳剂。将被检的痰、尿、粪便或病变组织接1：5的比例加人氢氧化钠消化液中，混匀后，37℃作用2h～3h，然后无菌滴加5%～10%盐酸溶液进行中和，将样本的pH调到6.8左右（此时显淡黄绿色），以1000g离心15min~20min，弃上清液，取沉淀物涂片镜检、培养。对痰液的消化浓缩还可采用以下处理方法：取4%氢氧化钠溶液50mL.0.1mol/L柠檬酸钠50mL，N-乙酰-L-半胱氨酸0.5g混合。取痰液按1：2的比例加入上述混合液，作用24h～48h，以1000g离心15min，取沉淀物涂片镜检、培养。6.3.3.3安替福民（antiformin）溶液处理法此法适用于痰、乳精液和子宫分泌液等的处理将被检样品置于试管中，加入3倍~4倍量的15%～20%安替福民溶液，充分摇匀后37℃作用1h，加1倍～2倍量的灭菌蒸馏水，摇勾，1000g离心20min～30min，弃上清液，沉淀物加蒸馏水恢复原量后再离心一次，联沉淀物涂片镜检、培养。6.4染色镜检
6.4.1涂片
先在玻片上涂布一层薄甘油蛋白，然后吸取处理好的样品滴加其上，涂布均匀如被检样品为乳汁等含脂肪较多的材料，在涂片制成后，滴加二甲苯或乙醚，使其覆盖整个涂片，摇4
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动1min～2min脱脂后倾去，再滴加95%酒精，以除去二甲苯，待酒精挥发后即可染色。6.4.2姜-尼氏抗酸染色
涂片经火焰固定后，滴加苯酚复红染色液，使其覆盖整个涂片。之后，将玻片置于火焰上加热至出现蒸汽但不产生气泡，脱离火焰，保持染色5mn。如热染过程出现染色液干滴，应及时添加，适量补充。充分水洗后滴加3%盐酸酒精脱色液，脱色30s～60s，至无色素脱下为正止。充分水洗，以骆氏美蓝染色液复染1min。水洗，吹干，镜检。6.4.3镜检
分枝杆菌为抗酸菌，因不被盐酸酒精脱色而染成红色，而其他细菌与动物细胞可被盐酸酒精脱色而均被染成蓝色。在显微镜下，分枝杆菌呈细长平直或微弯曲的杆菌，长1.5um～5μm，宽0.2μm~0.5μm，在陈旧培养基或干酪性淋巴结内，偶尔可见长达10μm或更长的菌体。6.5分离培养
将经过处理的病料接种到改良L丁培养基上，每份样品同时接种2管～4管，在37C培养1d后，以熔化的石蜡封口，继续培养至少8周（一般10周～12周）。结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，M.tuberculosis）菌落干燥、粗糙，呈白色、黄色或橙色并牢牢附着于培养基中，在TCH培养基上生长。牛分枝杆菌（Mycobacteriumbovis，M.bouis）在固体培养基上不产生任何颜色，菌落湿润、略显粗糙并发脆，如在培养基中加入1%的丙酮酸钠可促进其生长，在噻盼-2酸耕（TCH)培养基上不生长。禽分枝杆菌（Mycobacteriumavium，M.avium）在固体培养基上形成湿润、弥漫状、光滑及星光状菌落，在TCU培养基上生长。禽分枝杆菌可在42℃培养生长，结核分枝杆菌和牛分枝杆菌在42℃不生长。6.6生化鉴定
6.6.1生化特性
牛分枝杆菌、结核分枝杆菌和禽分枝杆菌的生化特性。见表1。表1牛分枝杆菌、禽分枝杆菌和结核分枝杆菌的生化特性生化试
验类型
牛分枝杆菌
禽分枝杆菌
结核分枝杆菌
对硝基苯
甲酸试验
TCH抗
性试验
尿素酶
硝酸盐
还原试验
耐热接触
酶试验
吐温-80
水解试验
注：“十”表示所有菌株阳性反应：“”所有菌株阴性反应；“士”多数菌株阳性反应，少数菌株阴性反应。6.6.2对硝基苯甲酸(PNB)试验
准备PNB培养基1支，L-J培养基1支，每支培养基接种10-3mg细菌：37℃孵育4周，每周观察一次结果并记录两种培养基上菌落的生长情况。牛分枝杆菌、结核分枝杆菌在PNB培养基上不生长6.6.3TCH抗性试验
将细菌接种TCH培养基和改良L-J培养基，37℃培养，1周后开始观察，培养8周。能同时在这两S
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种培养基上生长，且菌落符合结核分枝杆菌菌落特征者，判为TCH抗性试验阳性；若只能在L-J培养基上生长，而不能在TCH培养基上生长，则判为阴性。6.6.4尿素酶试验
准备两支试管，试管A加人3mLPBS（pH6.7.1/15mol/L）和1滴酚红指示剂；试管B加人用PBS(pH6.7,1/15mol/L)配制的0.12%尿素溶液和1滴0.1%酚红指示剂。挑取细菌约5mg移置于试管B中。两支试管均置37℃培养3d观察结果。A管空白对照不变色，B管菌液呈红色判为阳性，不变色者判为阴性。
6.6.5硝酸盐还原试验
挑取细菌约5mg，置于装有2mL硝酸盐还原试验溶液的试管中，充分混勾，置37℃水浴2h，滴加1滴2倍稀释的盐酸，2滴0.2%氨基苯磺胺，2滴0.1%N-甲基盐酸二氨基乙烯，混勾，观察结果。用PBS(pH7.0，1/15mol/L)取代硝酸盐还原试验溶液设一管空白对照。结果判定，1min内呈红色判为阳性；试剂混匀后1min内颜色无变化判为阴性，空白对照应呈无色或淡的粉红色。
6.6.6耐热接触酶试验
用生理盐水配制含菌量为10mg/mL的菌液，分装试管，每管0.5mL，分别置于68℃水浴20min，冷却后缓缓加入0.5mL过氧化氢（H，02）和吐温-80混合液（10%吐温-80加等量30%H202），肉眼观察结果。有持续小气泡产生的判为阳性，10min～20min仍无汽泡产生的判为阴性，6.6.7吐温-80水解试验
在装有2mL吐温-80水解试验溶液的试管中加入含菌量为10mg/mL的菌液0.5mL37℃培养3d～5d后观察结果。如试管内溶液由原来的琥珀色变为桃红色或红色者判为阳性，无颜色变化者判为阴性。
实时荧光PCR检测方法
7.1仪器与耗材
荧光PCR仪，恒温水浴箱，烘箱，台式冷冻离心机（离心力可达15000g），旋涡混匀器，冰箱（2℃～8℃、一20℃一80℃），微量可调移液器（10μL、100μL、1000μL）及配套带滤芯吸嘴，研钵，微量离心管，PCR光学管及管盖
7.2试剂
除特别说明，本标准所用化学试剂均为分析纯。7.2.1引物与探针
采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物与探针配制成100umol/L储存液，置一20℃或更低温度冻存；使用时取适量配制成10μmol/L工作液，避免多次冻融。荧光PCR引物与探针序列见表2。6
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结核分枝杆菌
牛分枝杆菌
禽分枝杆菌
表2荧光PCR引物与探针序列
核酸序列
上游引物：5'CGGTGTAATCAGTTTTGAAGC3下游引物：5'CGATTGGAACGGCGAAGC3SN/T1310—2011
探针\:5'-FAM-TAGGTAGTCCAGTAGAGCCCCATAGCCA3*-BHQ-1上游引物：5'ACGCCTTCCTAACCAGAATTG3”下游引物：5'GGCTATTGACCAGCTAAGATATCC3探针:5-FAM-AATTCATACAAGCCGTAGTCGTGCAGA A3-BHQ-1上游引物：5TCGATGACGCTGCTCTAAGG3下游引物：5'CCACACTCGGTCGGGTTC3探针:5-FAM-CCATACCGCTACTCCTGTCGTCGCA3'-BHQ-1a探针5\端标记的报告荧光基团及3端标记的淬灭基团可根据荧光PCR仪设备等具体情况另行选定7.2.2DNA提取液
含100mmol/LTris-HCl(pH8.0）.0.01%TritonX-100200μg/μL蛋白酶K。可采用等效商品化试剂。
7.2.3溶液
柠檬酸钠-磷酸缓冲液，柠檬酸钠缓冲液，0.5mol/LEDTA，4%氢氧化钠溶液，4%硫酸溶液，0.01mol/LpH7.6PBS。配制方法见附录A。7.2.470%乙醇
用新开启的灭菌双蒸水配制，一20℃预冷7.2.5
荧光PCR反应缓冲液
含50mmol/L氯化钾，10mmol/LTris-HCl(pH8.3）2.5mmol/L氯化镁，5%DMSO.5%甘油。可采用等效商品化试剂。
其他试剂
Tag酶，UDG酶，dNTP(dATP、dUTP、dCTP和dGTP）.无水乙醇，TritonX-1oo，异丙醇，三氯甲烷，灭菌双蒸水Www.bzxZ.net
7.3采样
7.3.1采样工具
采样工具需采用（121士2）℃/0.1MPa，15min高压灭菌并烘干，或经160℃干烤2h灭菌。7.3.2血样
用无菌注射器或真空采血管，自无菌动物静脉采血，无菌分离血清，用无菌注射器或真空采血管，自无菌动物静脉采血，将血液直接滴入抗凝剂中，并立即连续摇动，充TTKANYKAa
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分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液，或0.5mol/LEDTA。每6mL血液加1mL抗凝剂。条件充许时，应优先采集全血，以更有利于富集菌体。7.3.3奶样
无菌采集奶液于灭菌的容器中。一般以后段奶液含菌量较多，早晨挤出的奶液含菌量最高，7.3.4痰液
动物痰液采集：动物咯痰极少，宜在清晨采集，用橡胶管自口腔伸入至气管内，外接注射器吸取痰液。亦可取咳出的痰块。人痰液采集：采集清晨从肺深处咳出的痰液。用灭菌容器密闭送检7.3.5组织器官
采集动物下颌、咽后、支气管、肺（特别是肺门及肺门淋巴结）、纵隔和肠系膜淋巴结，以及病变组织器官（如：肝、脾、肺等）。
7.3.6粪便
采集混有粘液、血液、粘膜的粪便，或用刮匙从动物直肠深部（药30cm）取少量粘液粪便，盛于灭菌容器中。
7.3.7样品的保存和运输
待检样品在2℃～8℃保存不应超过24h；-20℃保存不超过3个月；一80℃以下长期保存。样品应置于低温、密封的容器内运输。7.4样品处理
7.4.1样品前处理
7.4.1.1血样前处理
取1mL～2mL全血样品，15000g离心10min，弃上清液；加等体积灭菌双蒸水充分振荡，15000g离心10m1；弃上清液，若红血球裂解不完全，应采用火菌双蒸水重复洗涤；收集沉淀物，继续进行核酸提取或置一20℃贮存备用。
取1mL~2mL血清样品，15000g离心10min，弃上清液，加1mL0.01mol/LpH7.6PBS.充分振荡混匀，15000g离心10min；弃上清液，收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置一20℃贮存备用7.4.1.2奶样前处理
取10mL奶液，加100μLTritonX-100.振荡混匀，2500g离心20min；弃上清液，取沉淀，加1mL0.01mol/LpH7.6PBS，充分振荡混勾；将沉淀悬浮液移人微量离心管，15000g离心10min；弃上清液，收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置一20℃存备用。7.4.1.3痰液的前处理
在痰液样品中加人2倍～4倍体积4%氢氧化钠溶液，振荡混匀，室温放置30min，间或振荡混匀，使其充分液化（无明显固状物并且吸出时无拖丝现象即为液化完全；若液化不完全，可适当再加人少量4%氢氧化钠溶液直至液化完全）；15000g离心10min；弃上清液，加1mL0.01mol/LpH7.6PBS，充分振荡混勾，15000g离心10min，弃上清液，重复本步骤1次；收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置一20℃贮存备用。
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7.4.1.4组织样品前处理方法
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取适量组织样品（剔除脂肪、被膜），剪碎，按1：5的比例加入柠檬酸钠-磷酸缓冲液（例，1g组织样品，加入5mL缓冲液），充分研磨；加等量4%氢氧化钠溶液，继续研磨5min～10min，使组织液化；移人离心管，充分振荡，75℃温浴0.5h～1h；取上清液（避免吸取粗渣），15000g离心10min；弃上清液，加等量0.01mol/LpH7.6PBS，振荡混勾，使沉淀充分悬浮，15000g离心10min，弃上清液，重复本步骤1次；收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置一20℃贮存备用。7.4.1.5粪样前处理
取粪样1g~2g，按1：5的比例加人4%硫酸溶液（例1g粪样，加5mL液体）充分振荡混匀，室温静置0.5h~1h；取上层约3mL液体（避免吸取粗渣），5000g离心1min，取上清液，15000g离心10min；弃上清液，加等量0.01mol/LpH7.6PBS，振荡混匀，使沉淀充分悬浮，15000g离心10min，弃上清液，重复本步骤1次；收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置一20℃贮存备用。7.4.2核酸提取
在上述已完成前处理的样品（沉淀物）中加人50μL100μLDNA提取液，充分振荡混匀，56℃温浴30min，98℃~100℃加热10min，瞬时离心使液滴聚集管底，加等体积三氯甲烷，振荡混匀，12000g离心5min，取上清液，直接用于PCR或贮存于一80℃备用（适用于除粪样外的其他样品）。其中粪样样品还应进行以下步骤：
加人等体积异丙醇（一20℃预冷），颠倒混匀，放置5min～10min；4℃，15000g离心10min，弃上清液，加3倍体积70%乙醇（4℃预冷），振荡洗涤；4℃，15000g离心10min，弃上清液，室温干燥5min；加入50μL无DNA酶、无RNA酶水，混匀、溶解核酸，直接用于PCR或烂存于一80℃备用。可采用经验证的商品化核酸提取试剂盒7.5实时荧光PCR检测
7.5.1对照设立
从样品处理开始，应设置阳性对照、阴性对照阳性对照：取已知阳性的同类样品做为阳性对照，也可将适量灭活病原菌添加到已知阴性样品中作为阳性对照样品。
阴性对照：取已知阴性的同类样品作为阴性对照空白对照：在扩增反应阶段设置。以灭菌双蒸水作为模板设置空白对照。7.5.2扩增试剂准备
采用25μL反应体系，含以下组分：10mmol/LTris-HCl（pH8.3），50mmol/L氯化钾，2.5mmol/L氯化镁，0.2mmol/LdNTP，上、下游引物各0.2μmol/L，探针0.1umol/L，5%DMSO，5%甘油，0.4UUDG酶，1UTaq酶，5μL模板。取出荧光PCR反应缓冲液等试剂，室温融化（Taq酶、UDG酶除外），瞬时离心后置冰上，根据上述体系、按每个反应20uL的用量配制荧光PCR预混反应液，不足部分加灭菌双蒸水补足，需配制的荧光PCR预混反应液数量=样品个数十对照个数十1。将各试剂按使用量吸取到微量离心管中，充分混匀，然后在每个PCR光学管中分装20uL。9
SN/T1310—2011
7.5.3加模板
在已分装有荧光PCR预混反应液的PCR光学管中每管分别加人5μL样品或对照的核酸模板混匀，盖上管盖，放人荧光PCR检测仪内，记录样品放置顺序。7.5.4荧光PCR扩增反应
结核分枝杆菌、牛分枝杆菌荧光PCR反应条件设定：第一阶段：50℃2min，95℃4min，1个循环；第二阶段：95℃10s60℃45s，40个循环，荧光收集设置在60℃退火延伸时进行。禽分枝杆菌荧光PCR反应条件设定：第一阶段：50℃2min.95℃4min，1个循环；第二阶段：95℃10s，65℃30s，40个循环，荧光收集设置在65℃退火延伸时进行。荧光素设定：报告荧光（ReportDye)设定为FAM(或按探针实际标记的荧光基团设定），率灭荧光（QuenchDye)设定为None，校准荧光（Referencedye)设定为None。可根据不同品牌仪器说明等效设置参数。
7.5.5分析条件设定和结果判定
综合分析仪器给出的各项结果，基线（baseline)以仪器给出的默认值作为参考，阈值（Threshold)设定原则以國值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准，具体还需根据仪器噪音情况进行调整，选择反应所设定的荧光基团对应的通道进行分析。7.5.6质控
阴性对照和空白对照应无Ct值，阳性对照的Ct值应≤30，且呈现S型典型扩增曲线。否则，此次实验视为无效。
7.5.7荧光PCR结果分析及判定
在质控有效的条件下进行结果判定。阴性反应结果判定：检测结果呈现无Ct值、无扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期，判为荧光PCR阴性反应。
阳性反应结果判定：检测结果呈现Ct值≤35、且扩增曲线有明显的对数增长期，判为荧光PCR阳性反应。
对于358.1仪器与耗材
PCR仪，PCR反应管，电泳仪，电泳槽，凝胶成像系统或紫外透射仪，其余同7.1。8.2试剂
8.2.12XPCR反应液
含0.1UTagPolymerase/μL.dATP.dTTP.dCTP和ldGTP各50oμmol/L,2ommol/LTris-HCI（pH8.3），100mmol/L氯化钾，3mmol/L氯化镁。可采用等效商品化试剂。10
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