【行业标准】 猪传染性胸膜肺炎检疫技术规范

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T14472011
代替SN/T1447.1-—2004,SN/T1447.2—2005猪传染性胸膜肺炎检疫技术规范Quarantine protocol for infectious pleuropneumonia of swine2011-05-31发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-12-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
猪传染性胸膜肺炎检疫技术规范SN/T1447—2011
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×1230
2011年12月第一版
印张1.5
字数41千字
2011年12月第一次印刷
印数1-1600
书号：155066：2-22611
定价24.00元
TIKANYKACA
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T1447—2011
本标准代替SN/T1447.1—2004《猪传染性胸膜肺炎阻断酶联免疫吸附试验》、SN/T1447.2—2005《猪胸膜肺炎放线杆菌聚合酶链式反应操作规程》。本标准与SN/T1447.1-2004和SN/T1447.2—2005相比，主要技术变化如下：增加了细菌分离鉴定；
-补体结合试验
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局本标准主要起草人：王巧全、李树清、张强、李健、胡永强、刘俊平、熊炜。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-SN/T1447.1—2004；
-SN/T1447.2—2005。
TIKANYKACA
1范围
猪传染性胸膜肺炎检疫技术规范SN/T1447—2011
本标准规定了猪传染性胸膜肺炎的细菌分离鉴定、聚合酶链式反应、补体结合试验、阻断酶联免疫吸附试验等实验室检测的操作程序及技术要求，本标准适用于猪传染性胸膜肺炎的检疫、诊断、流行病学调查和免疫监测规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18088出人境动物检疫采样。3疾病简介
参见附录A。
4现场检疫及采样
4.1现场检疫
逐头进行临床检查，根据动物病情、临床表现和特异性病理变化做出初步诊断。4.2采样
4.2.1病料的采集标准
按GB/T18088规定采样。
4.2.2活体病料采集
用棉拭子采鼻腔分泌物，放入无菌试管中送实验室进行检验。4.2.3组织样品的采集
无菌采集具有典型病变的肺气管、肺门淋巴结、扁桃体4.2.4血样的采集制备免费标准下载网bzxz
无菌操作采集动物血，每头不少于10mL。自然凝固后无菌分离血清，分装，加盖密封后冷藏保存。5
实验室诊断
5.1总则
对该病可以进行细菌分离鉴定分子生物学或血清学检查等1
TTKANYKAa
SN/T1447—2011
其中细菌分离、聚合酶链式反应主要检病原，补体结合试验、酶联免疫吸附试验主要检抗体。5.2细菌分离鉴定
5.2.1试剂
营养琼脂、血琼脂、巧克力琼脂、类胸膜肺炎微生物(PPLO)琼脂5.2.2病原分离
将样品按常规分离要求直接接种到血琼脂表面，再用鸡表皮葡萄球菌作交叉划线于37℃含5%二氧化碳（CO）下培养。继代培养用巧克力琼脂和PPLO琼脂进行培养5.2.3病原鉴定
培养形态及染色特性：
于血琼脂平板培养24h～48h，胸膜肺炎放线杆菌（APP）为露珠样的小菌落.直径1mm~2mm。多数菌株产生β溶血带，靠近鸡表皮葡萄球菌菌苔的菌落较大，随着与葡萄球菌生长线的距离增加而变小或不生长，即所谓“卫星现象”。取典型菌落作革兰氏染色，应为革兰氏阴性小球杆菌，两极着色继代培养中呈明显多形态，幼龄培养物中偶有成丝状。
5.2.4判定
被分离菌具有以下特点即可初步判定为猪胸膜肺炎放线杆菌：染色镜检为革兰氏阴性杆菌或多形态；在血琼脂培养基上生长具有溶血现象；一生长培养需要v因子，即具有“卫星现象”；被检菌生化特性：尿素酶试验为阳性，能分解D-木糖、甘露醇，不分解棉子糖、阿拉伯胶糖。5.3猪胸膜肺炎放线杆菌聚合酶链式反应5.3.1设备和材料
仪器设备
5.3.1.1.1PCR扩增仪。
5.3.1.1.2电泳仪。
5.3.1.1.3凝胶成像系统。
2试剂
5.3.1.2.1三蒸水0.103MPa灭菌15min。5.3.1.2.2吐温-20(Tween-20)0.103MPa灭菌15min3琼脂糖。
5.3.1.2.3
5.3. 1.2.4
溴化乙锭。
5Taq酶。
5.3.1.2.5
525mmol/L氯化镁。
5.3.1.2.6
5.3.1.2.7
5.3.1.2.8
2. 5 mmol/L dNTP。
分子量指示物：100bp2000bpDNAmarkerTKANYKAa
SN/T 1447—2011
5.3.1.2.9PBS、Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE）、琼脂糖凝胶、6X加样缓冲液（见B.6）、10XPCR缓冲液（见B.7）。
5.3.1.3引物
引物见表1。
表1引物
核苷酸序列
5'-ctttagggaggggtagaatt-3'
5-gattactagcgattccgactt-3
5-cgtaactcggtgattgatgc-3
5'-cgtttgctcattcgataaacg-3
5'-gtgcgggtaatgatacggtt-3\
5-cggctaaaccaaagttcggat-3
上游引物forwardprimer。
h下游引物reverseprimer。
5.3.2操作步骤
被检菌株、扁桃体、肺等组织样品及鼻拭子。5.3.2.2
样品处理
引物浓度
μmol/L
产物大小
菌株：挑取可疑菌落于pH7.20.01mol/LPBS中，制成约10°菌悬液（液体稍浑浊），再用PBS进行10倍、100倍稀释。原液、10倍和100倍稀释液均作为复合PCR扩增的模板。组织样品及鼻拭子：取组织0.5g~1g剪碎，加人1mLPBS缓冲液，匀浆。鼻拭子在1mLPBS缓冲液中反复挤压。分别将挤下的液体和组织匀浆液100g离心5min，弃沉淀。上清液10000g离心5min，弃上清液。沉淀加入50uLPBS和1uL灭菌吐温-20，一20℃冷冻15min，取出立即置100℃水浴中煮沸5min，重复冻融、煮沸两次。10000g离心5min，留上清液，取部分上清液进行10倍、100倍稀释。原液、10倍和100倍稀释液均作为套式PCR扩增的模板。APP阳性和阴性组织进行同样的处理。
5.3.2.3复合PCR
5.3.2.3.1对照设立
阳性对照用胸膜肺炎放线杆菌标准菌株DNA阴性对照用林氏放线杆菌（Actinobacilluslignieresii）菌株DNA空白对照用等体积的水代替模板APP菌株的培养（方法见C.2)。DNA的提取（方法见D.2）。3
KAKACa
SN/T1447—2011
5.3.2.3.2PCR反应体系
总体积30μL，10×PCR反应缓冲液3μL，氯化镁3μL；dNTP3μL；引物S7和S10各0.5μL；P1和P4各0.75μL：1μL模板，阳性和阴性对照10ng～20ngDNA：1单位TaqDNA聚合酶，并加人1%灭菌吐温-20，补充水至30μL。5.3.2.3.3循环参数
PCR反应为96℃6min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，35个循环；72℃5min。5.3.2.3.4电泳
取产物10μL与2μL6×加样缓冲液混合，加样于含EB的1.5%琼脂糖凝胶中。在1XTAE缓冲液中，3V/cm4V/cm电泳约30min，当溴酚蓝到达底部时停止电泳，用凝胶成像系统分析
阳性、阴性、空白对照和DNA相对分子质量指示物同样电泳。5.3.2.4套式PCR
5.3.2.4.1对照设立
阳性对照用胸膜肺炎放线杆菌标准菌株DNA，或已知APP阳性组织制备的模板阴性对照用林氏放线杆菌菌株DNA，或已知APP阴性组织制备的模板。空白对照用等体积的水代替模板。5.3.2.4.2反应体系
总体积30μL10×PCR反应缓冲液3μL；氯化镁3μL；dNTP3μL；每轮相应引物各0.5μL；1μL模板，阳性和阴性DNA对照10Pg～20PgDNA；第一轮用1单位TagDNA聚合酶，并加人1%灭菌吐温-20。第二轮用0.5单位TagDNA聚合酶；补充水至30μL。5.3.2.4.3循环参数
第一轮PCR使用引物P1/P4，96℃6min；94℃30s，55℃30s72℃45s.25个循环；72℃5min。
取第一轮PCR反应产物1μL，用引物P6/P8进行第二轮PCR扩增94℃3min；94℃30s.55℃30s.72℃45s35个循环；72℃3min。5.3.2.4.4电泳
按5.3.2.3.4操作。
5.3.3结果判定
5.3.3.1复合PCR
阳性对照会出现692bp和363bp的DNA片段。阴性对照会出现692bp的DNA片段，但不出现363bp的DNA片段。空白对照在692bp和363bp均没有核酸带。对照成立才能进行判定
菌株原液、10倍和100倍稀释菌悬液经复合PCR扩增后：在692bp和363bpDNA位置上都有核4
TTKANYKAa
SN/T1447-2011
酸带，判为阳性菌株。阳性菌株PCR产物应通过核酸序列测定，并与标准参考序列比对，进行确诊无核酸带或带的大小不在363bpDNA位置上判为阴性菌株。5.3.3.2套式PCR
阳性对照会出现223bp特异的DNA片段。阴性和空白对照均没有该核酸带。对照成立才能进行判定
待测样品原液、10倍和100倍稀释液经套式PCR扩增后：在223bpDNA位置上有核酸带，判为阳性样品。阳性样品PCR产物应通过核酸序列测定，并与标准参考序列比对，进行确诊。无核酸带或带的大小不在223bpDNA位置上，判为阴性样品。5.4补体结合试验
5.4.1材料准备
巴比妥缓冲液（VBD）
配制方法见附录E。
5.4.1.2标准抗原和血清
标准抗原、标准阳性血清、标准阴性血清需添加到补体中的标准特牛血清。5.4.1.3溶血素效价滴定
先将溶血素用VBD作1：100稀释（取0.2mL含等量甘油的溶血素，加9.8mLVBD）.按表2制备6管不同稀释倍数溶血素。
表2稀释溶血素
试管号
稀释倍数
1+100溶血素
1:1000溶血素
单位为毫升
取6支试管，分别标上6个溶血素浓度，每管各加1.0mL标准红细胞悬液（见附录F），再加上不同稀释倍数的溶血素1.0mL到相应的试管中，37℃水浴15min，即成致敏红细胞。用冷至4℃的VBD液将补体作1：400稀释，放4℃冰箱于2h内使用。取6支试管，分别标上各溶血素稀释度，每管加VBD0.4mL，1：400补体0.4mL（根据补体效价高低，可用大于或小于1：400的稀释度），再在各管内加人不同稀释度溶血素致敏红细胞悬液0.2mL。混匀后置37℃水浴1h，取出后以1000g离心5min，与标准溶血管（见附录G）比较，求得各管溶血度的百分率。
以各管溶血度的百分率为纵坐标，稀释倍数为横坐标（以1：1000稀释度的适当长度为1,1：2000为1/2，1：2500为2/5.1：3000为1/3，1：4000为1/41：8000为1/8。）画图。合适的溶血素效价为平稳区的第二个稀释度。
TTKANYKAa
SN/T 1447—2011
5.4.1.4补体效价滴定
5.4.1.4.1取4支试管，按表3加入试剂，混匀，37℃水浴30min.期间摇匀一次。表3补体效价滴定
1：400稀释补体
致敏红细胞
单位为毫升
5.4.1.4.2取出后，1000g离心5min，与标准溶血管（见附录G)比较，当一管与标准管不能确切相比时，取左右两标准管溶血度平均值。5.4.1.4.3补体单位50%溶血补体量（C\H）的确定：先计算每管的溶血比率，溶血百分比/非溶血百分比[例如溶血百分比为35%，则比率为35/(100-35)=0.54]，以每管的溶血比率为横坐标，每管所用1：400稀释补体的毫升数为纵坐标，在双对数坐标纸上作图。将头二管二点连成一线，找出中间点，后二管二点同样处理.将二线的中间点作成一线，从此线与“1”的交叉处画一水平线.读出1：400稀释补体的CHs的毫升数。在试验中需用5个CHs05个CHs补体的稀释倍数的计算：（400X0.4）/（1：400稀释补体的CHs,的毫升数X5）5.4.1.5致敏红细胞
制备方法见附录F。
标准溶血管
制备方法见附录G。
5.4.2操作方法
待检血清以及标准阳性血清、阴性血清均用VBD作1：10稀释，于60℃水浴锅中灭活5.4.2.1
30min。
5.4.2.2加0.025mL已1：10稀释好的血清到微量板的相应孔，加双孔，其中一孔为检测抗补体。5.4.2.3设置血清抗补体，阴性血清、阳性血清对照，VBD、抗原和红细胞对照。5.4.2.4加0.025mL最适合工作抗原到稀释血清孔和抗原对照孔，血清抗补体孔、VBD对照孔、红细胞对照孔分别加VBD0.025mL、0.05mL和0.1mL。5.4.2.5加0.05mL含5CH，的补体，将微量板振荡混勾1min后，加盖，置4℃冰箱冷感作15h~18h。
每孔加0.025mL致敏红细胞，振荡1min，使致敏红细胞悬浮，置37℃孵育30min。5.4.2.71
以1000g离心5min后，与标准比色，判定。5.4.3判定
对照组应符合正确溶血百分比（见表4），试验方成立，否则应重做6
TTKANYKAa
被检血清
补体结合试验正式试验操作表
阳性血清对照
1：10
阴性血清对照
1：10
板振荡混匀1min后，加盖，置4℃冰箱冷感作15h~18.h致敏红细胞
5C'Hso
37℃孵育30min，以1000r/min离心5min后，与标准比色判定对照正确
溶血（%)
5.4.3.2判定标准如下：
被检血清1：10稀释≤30%溶血为阳性；被检血清1：10稀释>50%溶血为阴性；100
介于阴、阳性之间为可疑，应重检，仍为可疑判为阳性。5.5阻断酶联免疫吸附试验
5.5.1材料
5.5.1.1试剂
5.5.1.1.1
5.5.1.1.2
5. 5. 1. 1. 3
5.5.1.1.4
5.5.1.1.5
5.5.1. 1.6
5. 5. 1. 1. 7
5.5. 1. 1.8
5.5.1.1.9
5.5.1.1.10
磷酸氢二钠（NazHPO，·12H2O)。磷酸二氢钾（KH,PO）。
氯化钠(NaCI）。
柠檬酸(C.HO,·HO)。
邻苯二胺（OPD）。
30%过氧化氢（H，O）。
硫酸（H,SO）。
吐温-20（Tween-20）。
牛血清白蛋白（BSA）。
补体对照
5C'H5o
包被液、稀释液、洗液、酶底物溶液和终止液的配制见附录H。注：所有化学试剂均为分析纯。5.5.1.2
仪器设备
5.5.1.2.196孔酶标板、
多通道、单通道可调移液器及加样头。5.5.1.2.2
5.5.1.2.3
天平（0.0001g）。
TKANYKAA
SN/T1447—2011
单位为微升
SN/T1447—2011
5.5.1.2.4
低速离心机。
5.5.1.2.5酸度计。
5. 5. 1. 2. 6
S酶标仪。
5.5.1.2.7恒温箱。
标准试剂
猪传染性胸膜肺炎标准抗原。
5.5.1.3.1
猪抗传染性胸膜肺炎标准阳性血清。5.5.1.3.2
5.5.1.3. 3
标准猪阴性血清。
5.5.1.3.4兔抗猪传染性胸膜肺炎标准阳性血清。5.5.1.3.5辣根过氧化物酶标记的猪抗免IgG。5.5.2采样
被检动物无菌采血5mL，待血液凝固后，以2000g离心10min，分离血清，血清一20℃保存。5.5.3操作方法
包被抗原
将猪传染性胸膜肺炎抗原用包被液稀释成工作浓度，包被酶标板，每孔100uL，加盖后，放置4℃冰箱过夜。
5.5.3.2封闭
次日取出酶标板，置37℃恒温箱或室温30min后，弃去包被液，每孔加200uL稀释液，37℃孵育1h。
5.5.3.3洗板
取出酶标板弃去液体后，每孔加洗液300μL，洗板，共3次，每次2min。最后一次倒置拍干。5.5.3.4加样
被检血清用稀释液作1：4稀释，每份血清加2孔，每孔100μL。设立下列对照：猪抗传染性胸膜肺炎标准阳性血清（阳性对照）、标准猪阴性血清（阴性对照）、兔抗猪传染性胸膜肺炎标准阳性血清（兔抗APP对照）、空白对照。阳性、阴性血清对照同被检血清一样，用稀释液作1：4稀释，每个对照加2孔，每孔100uL。免抗APP对照和空白对照同样加两孔，每孔加100uL稀释液，37℃作用1h。5.5.3.5加免抗猪传染性胸膜肺炎高免血清用稀释液将免抗猪传染性胸膜肺炎标准阳性血清稀释成工作浓度，每孔100uL，空白对照每孔加100uL稀释液，37℃作用30min。5.5.3.6洗板
按5.5.3.3操作。
5.5.3.7加猪抗兔IgG-辣根过氧化物酶结合物用稀释液将酶结合物稀释成工作浓度，每孔100L，37℃作用1h8
5.5.3.8洗板
按5.5.3.3操作。
加酶底物溶液
每孔加100μL，37℃作用20min。5.5.3.10终止反应
取出反应板，每孔加50μL终止液终止反应。5.5.3.11
测吸光值
用酶标仪在490nm波长下，以空白对照为参照，测定其吸光值（OD）。5.5.4数据计算
5.5.4.1计算平均吸光值：被检样品和各对照的两孔吸光值之和除以2。2计算相对平均吸光值：被检样品及对照均按式(1)计算相对平均吸光值。5.5.4.2
式中：
A——相对平均吸光值；
B——样品（对照）平均吸光值；C——标准阴性平均吸光值。
结果判定
号×100%
SN/T 1447—2011
阳性对照相对平均吸光值应小于20%，免抗APP对照相对平均吸光值应大于40%。对照成立才能对样品进行判定。
阳性反应：被检血清相对平均吸光值小于20%。疑似反应：被检血清相对平均吸光值20%～40%，疑似反应的样品进行重复试验，若仍为疑似反应则判为阳性。
阴性反应：被检血清相对平均吸光值大于40%。废弃物处理和防止污染的措施
检验过程中的废弃物，收集后高压灭菌或在焚烧炉中焚烧处理检验过程中应采取必要的防止交叉污染的措施，特别是PCR检测过程中应严格遵循PCR操作要求。
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。