【行业标准】 真鲷虹彩病毒检疫规范

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1675—2011
代替SN/T1675—2005
真鲷虹彩病毒病检疫技术规范
Quarantine protocol for red sea bream iridovirus disease (RSIVD)2011-05-31发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-12-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
真鲷虹彩病毒病检疫技术规范
SN/T16752011
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：68523946
68517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×1230
印张1
字数25千字
2011年11月第一版
2011年11月第一次印刷
印数1-1600
书号：155066：2-22639
定价18.00元
TIKANYKACA
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1675—2005《鱼真鲷虹彩病毒聚合酶链反应操作规程》。本标准与SN/T1675—2005相比，主要技术差异如下：增加现场诊断；
增加间接荧光抗体试验；
一增加病毒的细胞分离；
对原标准中聚合酶链式反应(PCR)进行修改本标准修改采用了OIE《水生动物疾病诊断手册》（2009版）第2.3.7章。SN/T1675—2011
本标准与OIE《水生动物疾病诊断手册》（2009版，第2.3.7章）相比，主要差别如下：删除了OIE手册中真鲷虹彩病毒病防控和流行病学内容；重新编排了格式
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：吴文忠、兰文升、刘、吴海峰、方成俊、张伯强、郑腾。TIKANYKACA
1范围
真鲷虹彩病毒病检疫技术规范
SN/T1675—2011
本标准规定了真鲷虹彩病毒病（redseabreamiridovirusdisease，RSIVD）的临床和实验室检测标准方法。
本标准适用于水生动物真鲷虹彩病毒病的检测和诊断。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T18088出人境动物检疫采样。3概述
真鲷虹彩病毒病（RSIVD)是养殖海水鱼类的一种重要疾病，被列人世界动物卫生组织（OIE)水生动物疫病名录，是水生动物及其产品的国际贸易中，所监测的鱼类重要疾病之一（参见附录A）。对RSIV的监测、检测和诊断方法见附录B。4缩略语
下列缩略语适用于本文件
CPE（cytopathiceffect）：细胞病变IFAT（immunofluorescentantibodytests）：免疫荧光抗体试验ISKNV(infectiousspleenandkidneynecrosisvirus）：传染性脾肾坏死病毒PCR（polymerasechainreaction）：聚合酶链式反应RSIVD(redseabreamiridoviraldisease)：真鲷虹彩病毒病RSIV（redseabreamiridoviralvirus）：真鲷虹彩病毒主要仪器和设备
5.1普通倒置显微镜。
5.2荧光显微镜。
5.3电子显微镜。
5.4热循环扩增仪（PCR仪）。
5.5恒温培养箱。
离心机。
凝胶成像仪
DNA电泳系统。
TKANYKAa
SN/T 1675—2011
主要试剂和材料
GF(Gruntfin）细胞系：由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供6.1
L-15培养基（含Eagles平衡盐溶液）。6.3
小牛血清(FBS)。
标记了异硫氰酸荧光素（FITC)的抗小鼠的抗抗体。抗RSIV的单克隆抗体：由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供。6.5
PCR有关试剂。
RSIV：由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供6.8引物：
引物1:1-F:5'-CTCAAA CAC TCT GGCTCA TC-3\引物2:1-R:5-GCA CCA ACACAT CTCCTATC-3\引物1和引物2可扩增RSIV和ISKNV中570bp的基因片段。引物3:4-F:5'-CGGGGGCAATGACGACTACA-3'引物4:4-R:5'-CCGCCTGTGCCT TTT CTGGA-3\引物3和引物4只扩增RSIV568bp的基因片段7抽样
出境检疫抽样应在原产养殖场进行，进境检疫抽样应在进出境临时检疫隔离场（池）进行，抽样要求根据GB/T18088的要求执行，抽样数按照附录C确定。8现场诊断
8.1临床症状
感染鱼活力差、严重贫血、鳃丝有出血点、脾脏肿大8.2
显微病理
组织涂片
脾脏组织涂片后，经Giemsa染色，可看到异常的巨大细胞。8.2.2
2切片
在脾脏、心脏或肠等组织中可见异常的巨大细胞。8.2.3
显微病理
通过电子显微镜观察，在巨大细胞中可见直径为200nm～240nm的病毒粒子。9病毒的细胞分离
9.1病原接种细胞
9.1.1使用GF(Gruntfin)细胞系分离病毒2
TKANYKAA
SN/T1675—2011
9.1.2从病鱼的脾和（或）肾组织采集样品，研磨成为组织匀浆，含10%小牛血清（FBS)的L-15培养基（含有1000IU/mL青霉素和50ug/mL链霉素）稀释组织细胞并且置于25℃培养箱中孵育24h，以保证随后RSIV的成功分离
9.1.3以RSIV病毒作为阳性对照，未感染的细胞作为阴性对照。随后出现病毒性细胞病变（CPE）可以使用间接免疫荧光抗体试验（IFAT)和（或）聚合酶链反应（PCR）鉴定病毒。9.1.4把10倍稀释的组织匀浆上清液再做10倍稀释，在无困条件下，分别以适当的体积接种生长了24h的单层细胞，每100μL稀释液接种到单层细胞的面积应不小于2cm。9.1.5在25℃±1℃恒温环境吸附0.5h~1h，加入含有2%胎牛血清的细胞培养液（pH7.6），保证24孔板每孔接种1mL，然后置于25℃土1℃恒温培养箱继续培养。9.2细胞培养的观察
9.2.1每天观察接种的样品及阳性对照，持续观察10d。如果稀释的匀浆上清液接种后，在细胞培养中出现CPE，立即进行鉴定。
9.2.2如果接种10d后没有CPE出现（阳性对照已出现CPE），7d后要再传代培养一次。9.2.3如果阳性对照一直没有CPE，则要用新的敏感细胞及新批次样品重新进行接种试验。9.3传代培养和结果判定
从所有接种了组织匀浆上清液的细胞培养板的孔中收集细胞培养液。9.3.1
9.3.2按9.1.4描述的方法接种到单层细胞。9.3.3按9.2.1描述进行培养和观察。9.3.4如果CPE仍未出现，则试验结果判为阴性。10
间接荧光抗体试验
10.1鉴定RSIV感染单层细胞的间接荧光抗体试验10.1.1总则
检测的样品为丙酮固定的感染并出现了CPE的单层细胞，用无感染的单层细胞作为阴性对照，用RSIV感染的单层细胞作为阳性对照，从细胞培养中分离到病毒后，直接利用间接荧光抗体试验进行鉴定。
10.1.2试验步骤bzxz.net
10.1.2.1在载玻片上制备单层细胞10.1.2.1.1将细胞液加至具有旋涡的载玻片上，细胞培养液中的小牛血清（FCS）可减少到2%~4%，通常在25℃土1℃孵育24h，单层细胞即可覆盖80%的盖玻片。10.1.2.1.2准备好用作感染的单层细胞后，在当天或传入细胞的第2天，直接将10倍稀释的待鉴定的病毒悬液无菌接种到细胞培养孔，在25℃培养24h～72h。10.1.2.1.3当CPE出现时，吸出细胞培养液，用PBS漂洗3次，然后用预冷固定液漂洗3次，空气中干燥.用冷丙酮（一20℃）固定10min，10.1.2.1.4单层细胞在空气中干燥至少30min，然后立刻做下一步处理或置于一20℃保存。10.1.2.2单层细胞的处理
10.1.2.2.1制备抗RSIV的单克隆抗体溶液，将单层细胞在37℃的湿盒子里用抗RSIV的单克隆抗TTKANYKAa
SN/T1675—2011
体作用30min，用PBS把单层细胞洗3次，约5min。10.1.2.2.2加人适当浓度标记了异硫氰酸荧光素（FITC)的抗小鼠的抗抗体在暗的湿盒中37℃培育30min。用PBS将单层细胞洗3次，约5min。用pH8.5的甘油盐水封片，立即用显微镜观察处理过的单层细胞。
10.1.3结果判定
用荧光显微镜检查处理的玻片，阳性和阴性对照应完全成立，这样才能进行其他样品的观察。如细胞质中充满弥散性的荧光，则检测结果为阳性。10.2病料组织的间接荧光抗体试验（IFAT）10.2.1实验步骤
10.2.1.1取样部位
取牌脏。
10.2.1.2阳性和阴性对照的选用用已经确诊感染鱼的脾脏组织制备的涂片作为阳性对照，作为阳性对照所用的鱼脾牌脏组织风干和固定的涂片可以从OIE参考试验室获得。用健康鱼的脾脏组织制备的涂片作为阴性对照。10.2.1.3样品处理
放尽鱼血，取脾脏置于干净的载玻片上涂片。将涂片在空气中干燥20min，冷丙酮固定，用抗RSIV的单克隆抗体在37℃对涂片作用30minPBS洗3次，约5min。10.2.1.4样品显色
加人适当浓度标记了异硫氰酸荧光素（FITC)的抗小鼠的抗抗体在暗的湿盒中37℃培育30min，标记FITC的抗体通常是免源或羊源抗体。用PBST把单层细胞洗3次，约5min。用pH8.5的甘油盐水封片，立即用显微镜观察处理过的单层细胞。10.2.1.5结果观察
用荧光显微镜检查。阳性和阴性对照应完全成立，这样才能进行其他样品的观察。异常肿大的细跑带有荧光即可以证实可能感染RSIV10.2.2结果判定
如果实验结果为阳性，可以初步判断抽样的鱼感染了RSIV并患有RSIVD。如果实验结果为阴性，则将组织器官样品按前面所描述的进行细胞培养分离病毒，进一步确诊。11聚合酶链式反应（PCR）
11.1实验步骤
11.1.1样品
为病鱼的脾组织或细胞培养中出现CPE的上清液。TTKANYKAa
11.1.2阳性和阴性对照
SN/T1675—2011
从非感染鱼脾或非感染的细胞培养上清液提取的DNA作为阴性对照。用被证实感染RSIV的鱼脾组织或被感染细胞培养物的上清液提取的DNA作为阳性对照。对照的选择取决于被检测样品的种类。
11.1.3抽提DNA
从器官样品或分离病毒的细胞培养上清液中提取DNA。核酸提取可使用市售商品化的DNA抽提试剂盒。用已证实感染RSIV或ISKNV的器官或细胞培养上清液作为阳性对照，用健康鱼组织或无病毒感染细胞培养物的上清液作为阴性对照。11.1.4PCR扩增
11.1.4.1引物的选用
在PCR扩增中，上游引物1-F和下游引物1-R可以共扩增RSIV和ISKNV的基因片段，引物4-F和4-R只能扩增RSIV的基因片段。因此，引物4-F和4-R具有特异性鉴别RSIV和ISKNV的作用11.1.4.2DNA的扩增
将提取的DNA（1μL）加人到含有各引物（0.4μmol/L）dNTP（0.25mmol/L）、ExTaq（1.25U）和Mg+（2mmol/L）的PCR反应体系中，反应液在自动的热循环仪（PCR仪）按设计的程序运行：94C30s，58℃60s，72℃60s.扩增30个循环，最后于72℃延伸5min。PCR扩增反应产物用琼脂糖凝胶电泳分析。
11.2结果判定
11.2.1结果判定
阴性对照和空白对照没有该扩增带。待测样品电泳后，电泳后观察到预期长度的核酸片段，则判定为阳性，无扩增带或扩增带的大小不是预期长度的条带判为阴性11.2.2检测结果的释疑
用引物组1-F和1-R的PCR阳性结果且经测序证实其特异性后（参见附录D），表明存在RSIV或ISKNV,该病是RSIVD。如果用引物组1-F和1-R的PCR扩增反应出现阳性结果，继续使用引物组4-F和4-R做选择性PCR.阳性结果表明该病毒是RSIV.并引起RSIVD。选择性PCR的阴性结果表明该病毒是ISKNV，并由其引起RSIVD。如果PCR产物经过测序确诊（参见附录E）.则以测序结果为准。
12综合判定
12.1可疑病例的定义
满足以下条件之一，可怀疑存在RSIV或ISKNV：出现典型的临床症状，且用压片或组织切片证实异常肿大细胞的存在；a）
b）出现典型的临床症状且用电镜在异常肿大细胞中观察到病毒体粒子；病毒细胞分离出现特异性CPE：
d）组织压片出现IFAT阳性细胞
TKANYKAa
SN/T1675—2011
确诊病例的定义
除12.1的条件之外，满足以下条件一条或多条，将考虑确诊存在RSIV或ISKNV：病毒细胞分离出现特异性CPE，且感染细胞培养物IFAT结果呈阳性；a)
病毒细胞分离出现特异性CPE,用分离病毒提取的DNA作模板，PCR结果呈阳性；b)
用病灶组织提取DNA作模板，PCR结果阳性；出现典型异常肿大细胞的压片IFAT结果阳性TYKANYKAa
A.1危害和病毒特性
附录A
（资料性附录）
真鲷虹彩病毒病的危害和病毒特性SN/T1675—2011
真鲷虹彩病毒病（RSIVD）是引起养殖海水鱼类的重要疾病，是世界动物卫生组织（OIE）成员国必需申报和水产品国际贸易中监测的鱼类重要疾病之一·由虹彩病毒感染所致的水产动物疾病已成为世界水产养殖业的严重问题。近年来，在我国由真鲷虹彩病毒所引起的海水养殖鱼类疾病正日益加剧，引发多种经济名贵鱼如：大黄鱼、石斑鱼、鱼、牙鲆鱼、美国红鱼等大规模死亡，据统计，每年RSIVD给我国水产养殖业造成数十亿元的经济损失RSIVD的病原隶属于虹彩病毒科，细胞肿大虹彩病毒属，真鲷虹彩病毒（RSIV)病毒粒子呈六角形、正二十面体，直径为140nm～160nm左右，呈典型副晶格状排列。细胞肿大虹彩病毒属的其他成员都能够引起相似的疾病，即病灶细胞肿大，如RSIV或ISKNV病理特征相同，但是，基于单克隆抗体的免疫学方法却不能鉴别RSIV和ISKNV病原。而细胞肿大虹彩病毒属与蛙病毒属的病毒在遗传学和生物学特征上有很大的区别，蛙病毒属的所有成员对真鲷没有致病性，A.2是细胞肿大虹彩病毒属包括的所有已知病毒成员
真鲷虹彩病毒病（RSIVD)发病的适宜水温20℃～25℃，易感宿主是卵形、牙鲆、美国红鱼、真鲷、鱼等。该病主要症状与诊断：鱼体色变黑，无力地游在水面，外表症状不明显，个别眼球突出、出血，体表呈出血性擦痕。鱼鳃褪色，有的鳃上发现黑褐色或黑色颗粒。内脏诸器官褪色，脾脏肿大等特征；脾脏压片标本染色后，可见到肥大、球形化的细胞；采用免疫荧光单抗法或PCR方法可确诊A.2细胞肿大虹彩病毒属所有已知病毒成员Megalocytivirus
-Infectious spleen and kidney necrosis virus;African lampeye iridovirus;
Banggai cardinalfish iridovirusDwarf gouramiiridovirus;
Giant seaperch iridovirus;
Grouper sleepy disease iridovirus;Kinggrouperiridovirus;
Korean flounder iridovirus;
Large yellow croaker iridovirusLargemouth bass virus;
Megalocytivirusparadisefish/PF06/20o6/KORMegalocytivirusparadisefish/PF08/2o08/KOR；Olive flounderiridovirus;
-Orange-spotted grouper iridovirus;TKANYKAa
SN/T1675—2011
Pearl gourami iridovirus;
Red sea bream iridovirus;
Red sea bream iridovirus-K;
Rock breamiridovirus;
Sea bass iridovirus;
Sea bass iridovirus-K;
-Sea perchiridovirus;
Silvergourami iridovirus
Spotted knifejaw iridovirus;Turbot iridovirus;
Turbot reddish body iridovirus。o0
SN/T1675—2011
附录B
（规范性附录）
RSIV的监测、检测和诊断方法
RSIV的监测、检测和诊断方法
初步诊断
综合症状
用IFAT或PCR对细胞培养分离
的病毒进行生物鉴定
涂片直接光学显微镜观察
组织病理学
透射电子显微镜
分离病毒或涂片的间接荧光
抗体试验
DNA探针
推荐使用的方法，具有可用性、有效性、诊断的特异性和敏感性；A
标准方法，具有良好的诊断特异性和敏感性；B
C——在某些情形下应用的方法，但由于费用、精确度或其他方面的原因，很大程度上限制了它的应用；D—目前不推荐使用的方法。
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