【SN商检标准】 猪细环病毒检疫技术规范

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4750—2017 猪细环病毒检疫技术规范 Quarantine protocol for swine torquetenodes virus 2017-05-12 发布 2017-12-01 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国江西出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学院、江西省检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：杨春华、孙思扬、张强、陈庆富、周延、孙洁、祝建新、罗秋红、花群义。 1 范围 本标准规定了猪细环病毒PCR检测法和实时荧光PCR检测法的操作方法。本标准适用于猪及其产品中猪细环病毒核酸的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 SN/T 2025 动物检疫实验室生物安全操作规范 3 防污染措施 本标准涉及的所有操作应符合GB 19489及SN/T 2025的有关规定。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 4.1 DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate） 4.2 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） 4.3 EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid） 4.4 PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） 4.5 RNA：核糖核酸（ribonucleic acid） 4.6 SDS：十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate） 4.7 TTSuV：猪细环病毒（Swine Torquetenodes Virus）（参见附录A） 5 设备、材料和试剂 5.1 设备、材料 PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、高压灭菌器、冰箱、微量可调移液器及吸头、冷冻离心机、1.5 mL离心管。 5.2 试剂 除特别说明外，本标准所用试剂均为分子生物学级。试验用水应符合GB/T 6682的要求：样品裂解缓冲液（见B.4）、10% SDS、20 g/L蛋白酶K、RNA酶、酚/三氯甲烷/异戊醇（25:24:1）、异丙醇、70%乙醇（用无水乙醇和DEPC水配制）、DEPC水、PCR反应预混液、PCR引物（见B.6）、电泳缓冲液、琼脂糖、DNA分子质量标准（DNA Marker）、胶红（或同等效果核酸染料）、实时荧光PCR反应预混液、引物和探针（见B.7）。 6 样品的采集、前处理和DNA模板制备 6.1 总则 采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理应遵循GB 19489实验室生物安全通用要求。 6.2 样品采集 6.2.1 血液样品 用真空采血管采集样品，每管不少于5 mL，编号备用。每个样品更换一支采血针头。编号后的血样经4℃静置30 min，以4000 r/min离心10 min，吸取血清（上清液）至1.5 mL离心管内，编号备用。 6.2.2 组织样品 取1 g样品，经匀浆器研磨后，加入4 mL的样品裂解缓冲液（见B.4）悬浮，-20℃反复冻融3次，然后以5000 r/min离心5 min，取上清液备用。 6.3 样品运送 样品采集后，放入保温箱中，加冰，密封，送实验室。采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存不应超过24 h，若需长期保存，应放置-20℃（或以下）冰箱，冻融不超过3次。 6.4 样品DNA模板制备 6.4.1 酚/三氯甲烷/异戊醇抽提法 取处理好的血清/组织样品100 μL于1.5 mL离心管，加入样品裂解缓冲液500 μL，混匀，加入35 μL 10% SDS和6 μL 20 g/L蛋白酶K，56℃水浴作用30 min。然后加入RNA酶30 μg，37℃作用30 min。待样品冷却至室温，混匀，14000 r/min离心5 min；吸取上清液，加入等体积的酚/三氯甲烷/异戊醇（25:24:1）抽提，14000 r/min离心5 min；吸取上层液体，加入等体积的酚/三氯甲烷/异戊醇（25:24:1）再抽提1次，14000 r/min离心5 min；吸取上层液体加入等体积的异丙醇，沉淀DNA，室温放置10 min，14000 r/min离心5 min；倒掉液体，加入1 mL 70%乙醇洗涤1次，晾干，取30 μL灭菌水溶解DNA，贮存于-20℃备用或立即用于实时荧光PCR扩增。 6.4.2 商品化DNA抽提试剂盒提取法 按照使用的商品化DNA抽提试剂盒操作说明要求提取病毒DNA。 7 PCR法检测步骤 7.1 PCR反应体系 设反应数为n，n包括待检样品及重复、阳性对照、阴性对照和空白对照。每个PCR检测反应体系见B.8。 7.2 PCR反应参数 7.2.1 TTSuV 1a型PCR反应参数 94℃，5 min预变性；94℃，30 s变性，60℃，30 s退火，72℃，2 min延伸，35个循环；72℃，5 min延伸。 7.2.2 TTSuV k2型PCR反应参数 94℃，5 min预变性；94℃，30 s变性，62℃，30 s退火，72℃，2 min延伸，35个循环；72℃，5 min延伸。 7.3 1.5%琼脂糖凝胶电泳 用电泳缓冲液和琼脂糖配成浓度为1.5%的琼脂糖凝胶。取5 μL扩增产物进行电泳，同时设置DNA Marker，在凝胶成像系统下观察并记录电泳结果。 7.4 PCR对照设立 7.4.1 阳性对照 以TTSuV 1a型病毒DNA、TTSuV k2型病毒DNA分别作为TTSuV 1a检测、TTSuV k2检测的阳性对照。 7.4.2 阴性对照 以不含TTSuV的猪器官组织（或猪血清）DNA作为阴性对照。 7.4.3 空白对照 以水作为空白对照。 7.5 PCR结果判定 7.5.1 PCR阳性对照判定 TTSuV 1a型阳性对照，在272 bp位置出现目的条带。 TTSuV k2型阳性对照，在226 bp位置出现目的条带。 7.5.2 阴性对照判定 TTSuV 1a型阴性对照，在272 bp位置无目的片段条带出现。 TTSuV k2型阴性对照，在226 bp位置无目的片段条带出现。 7.5.3 空白对照判定 空白对照，无扩增条带出现。 7.5.4 样品结果判定 7.5.4.1 阴性 阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正确的条件下： 在272 bp位置无目的片段条带出现，表示样品中无TTSuV 1a型病毒核酸，表述为TTSuV 1a型核酸阴性。 在226 bp位置无目的片段条带出现，表示样品中无TTSuV k2型病毒核酸，表述为TTSuV k2型核酸阴性。 7.5.4.2 阳性 阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正确的条件下： 在272 bp位置出现目的条带，表示样品中有TTSuV 1a型病毒核酸，表述为TTSuV 1a型核酸阳性。 在226 bp位置出现目的条带，表示样品中有TTSuV k2型病毒核酸，表述为TTSuV k2型核酸阳性。 必要情况下，需进行测序验证，比对序列参见C.1和C.2。 8 实时荧光PCR法检测步骤 8.1 实时荧光PCR反应体系 设反应数为n，n包括待检样品及重复、阳性对照、阴性对照和空白对照。每个实时荧光PCR反应体系见B.9，目的片段序列参见C.3和C.4。 8.2 实时荧光PCR反应参数 反应参数为：95℃，90 s预变性；95℃，10 s变性；55℃，30 s退火延伸（收集荧光信号）；反应40个循环。 8.3 实时荧光PCR对照设立 8.3.1 阳性对照 见7.4.1。 8.3.2 阴性对照 见7.4.2。 8.3.3 空白对照 见7.4.3。 8.4 结果判定 8.4.1 实时荧光PCR结果分析条件设定 直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样本扩增曲线的最高点为准。 8.4.2 阳性对照判定 TTSuV 1a型阳性对照，FAM检测通道呈现出典型的阳性扩增曲线。 TTSuV k2型阳性对照，HEX检测通道呈现出典型的阳性扩增曲线。 8.4.3 阴性对照判定 TTSuV 1a型阴性对照，无典型扩增曲线。 TTSuV k2型阴性对照，无典型扩增曲线。 8.4.4 空白对照判定 空白对照，FAM通道和HEX通道Ct值均无典型扩增曲线。 8.4.5 样品结果判定 8.4.5.1 阴性 阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正确的条件下： FAM通道无典型扩增曲线，表示样品中无TTSuV 1a型病毒核酸，表述为TTSuV 1a型核酸阴性。 HEX通道无典型扩增曲线，表示样品中无TTSuV k2型病毒核酸，表述为TTSuV k2型核酸阴性。 8.4.5.2 阳性 阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正确的条件下： FAM检测通道Ct≤35，且有典型扩增曲线，表示样品中有TTSuV 1a型病毒核酸，表述为TTSuV 1a型核酸阳性。 HEX检测通道Ct≤35，且有典型扩增曲线，表示样品中有TTSuV k2型病毒核酸，表述为TTSuV k2型核酸阳性。 8.4.5.3 复验 无论FAM通道或HEX通道，35
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