【行业标准】 马立克氏病检疫技术规范

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1454—2011
代替SN/T1454—2004
马立克氏病检疫技术规范
QuarantineprotocolforMarek'sdisease2011-05-31发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-12-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准代替SN/T1454—2004《鸡马立克氏病病毒分离与鉴定方法》。本标准与SN/T1454—2004相比，主要技术变化如下：加人了临床诊断内容；
琼脂免疫扩散实验的内容。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T1454—2011
本标准起草单位：中华人民共和国陕西出人境检验检疫局、中华人民共和国山西出入境检验检疫局
本标准主要起草人：马玉玲、蒋宏伟、陈茂盛、巩红霞、米敬斌、高建新。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-SN/T1454—2004。
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1范围
马立克氏病检疫技术规范
本标准规定了马立克氏病的检疫技术要求本标准适用于马立克氏病的流行病学调查和口岸检疫2规范性引用文件
SN/T1454—2011
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
MD（marek'sdisease)：马立克氏病MDV（MDvirus）：马立克氏病病毒CEF（chickembryofibroblasts）：鸡胚成纤维细胞DEF（duckembryofibroblasts）：鸭胚成纤维细胞SPF（specificpathogenfree）：无特定病原体动物CPE（cytopathiceffect）：细胞病变4临床诊断与判定标准
4.1特征性发病症状
在鸡群中，临床症状表现为步态不稳、共济失调，一肢或多肢的麻痹或瘫痪，并且两腿前后伸展呈“劈叉”姿势时，一般可作为MD的示病症状，可初步判定为MD。4.2特征性病理变化
4.2.1神经型的病理变化为腰荐神经丛、坐骨神经丛、臂神经丛、颈部迷走神经丛等部位肿胀，呈半透明水肿样，色泽变淡，横纹消失，其肿胀程度一般为正常神经的2倍～3倍，且多为不对称性，通过比较对侧神经将有助于判定，
4.2.2皮肤型的病理变化为以皮肤的羽毛囊为中心，形成半球形隆起的肿瘤，其表面有时可见鳞片状棕色痴皮。
4.2.3眼晴特征性病理变化是淋巴细胞浸润虹膜而导致的病理变化.虹膜呈环状或斑点状褪色，出现淡灰色；瞳孔不规则，有时偏向虹膜一侧，1
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5实验室诊断
5.1琼脂免疫扩散试验（AGID）
5.1.1器材和试剂
5.1.1.1孔径4mm打孔器、直径90mm平皿、5uL~50μL微量移液器和微量吸头、量桶、吸管等。5.1.1.21%硫柳汞溶液：硫柳汞1g，蒸馏水100mL，溶解后置玻璃瓶盖塞备用。5.1.1.30.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）：配制见附录A。实验用水应符合GB/T6682要求。5.1.1.4抗原和标准阳性血清：由指定单位提供，按说明书使用5.1.1.5琼脂板的制备：在250mL容量的三角瓶中分别加入pH7.4磷酸盐缓冲液100mL、琼脂糖1g、氯化钠8g。将三角瓶在水浴中煮沸使琼脂糖充分融化，再加人1%硫柳汞1mL，混合均勾，冷却至45℃~50℃，将洁净干热灭菌的直径为90mm的平皿置于平台上，每个平血加入18mL～20mL。加盖待凝固后，把平皿倒置以防水分蒸发，放冰箱4℃中冷藏保存备用（时间不超过2周）。5.1.2样品的采集
5.1.2.1被检鸡的羽髓液：选拔含羽髓丰满的翅羽或身体其他部位的大羽数根剪下羽根部分，并按编号分别收集于相应的小试管内，向管内滴加2滴～3滴蒸馏水（羽髓丰满时也可不加），然后用玻璃棒挤压羽根，以适当的力转动玻璃棒即成。5.1.2.2被检血清：按常规方法采血分离血清。无溶血，无细菌污染。5.1.3操作方法
5.1.3.1抗体检测
5.1.3.1.1打孔：反应孔现用现打。在已制备好的琼脂板上，按图1打孔，孔径4mm，孔间距4mm，将孔中的琼脂用7号针头斜面向上从右侧边插入，轻轻向左侧方向挑出，勿损坏孔的边缘，避免琼脂脱离底部。用酒精灯火焰轻烤平血底部至琼脂轻微熔化为止达到封闭孔的底部，以防样品溶液侧漏。@
图1打孔示意图
5.1.3.1.2加样：在制备好的琼脂板中的①、③、③孔中用微量移液器加人各被检血清样品，在②、④、③孔内加阳性血清，在中心孔②加人标准抗原，每孔均以加满与琼脂表面形成一个平面为度，每加一个样品应换一个吸头。
5.1.3.1.3感作：加样完毕后，加上平皿盖，放人底面放置有湿纱布的带盖平底盒中，置37℃温箱中反应，分别在24h和48h观察结果。5.1.3.2抗原检测
操作方法同5.1.3.1，加样如下：将病鸡羽髓液按顺序分别加到②③@孔内，用微量移液器吸取2
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标准抗原分别加人①、④孔中，取标准阳性血清加到孔内，每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个吸头。
5.1.4结果判定及判定标准
5.1.4.1阳性
将琼脂板置侧强光下进行观察，被检样品孔与中心孔之间形成清晰的沉淀线，并与周边已知抗原和阳性血清孔之间的沉淀线相互融合。5.1.4.2弱阳性
被检样品孔与中心孔之间不出现沉淀线，而标准阳性血清与标准抗原孔之间所产生的沉淀线末端弯向被检样品孔内侧。
5.1.4.3阴性
被检样品孔与中心孔之间不出现沉淀线，标准阳性血清与标准抗原孔的沉淀线的末端向毗邻的待检样品孔直伸或向外侧偏弯曲
5.1.4.4可疑
介于阴性与阳性之间为可疑。可疑应重检，仍为可疑判为阳性。5.2病毒分离和鉴定
5.2.1试剂和材料
5.2.1.11日龄雏鸡：用SPF种蛋孵化5.2.1.2溶液及细胞培养液的制备：见附录A。5.2.1.3淋巴细胞分层液：由指定单位提供，按说明书使用5.2.1.4标准MDV分型单克隆抗体及免抗鼠免疫荧光抗体：由指定单位提供，按说明书使用5.2.2操作步骤
5.2.2.1DEF(CEF)的制备
5.2.2.1.1将SPF鸭种蛋孵化至12d~14:d(SPF种鸡蛋孵化至9d~10d)。5.2.2.1.2用碘和75%酒精消毒外壳，打开气室，用灭菌镊子取出胚体，置于火菌平皿，除去头、趾和内脏。将驱干用预冷的Hanks平衡盐溶液冲洗三次，剪碎。5.2.2.1.3用预冷的Hanks的平衡盐液尽可能地洗净组织碎块中的血液，再用胰蛋白酶溶液冲洗次，然后加入20mL～50mL的胰蛋白酶溶液，通过磁力搅拌均勾，在37℃水浴中消化15min。5.2.2.1.4通过双层消毒纱布过滤细胞悬浮液，将滤液收集于灭菌离心管，以1000r/min离心10min，弃去上清液，加入预冷的Hanks平衡盐溶液用同样的离心方法洗涤两次，5.2.2.1.5弃去上清液.每1mL细胞沉淀加入细胞生长液9mL制成10%的悬浮液，再用细胞生长液做1：40稀释，分装于细胞培养瓶中，37℃培养48h即可作鸭胚（鸡胚）成纤维细胞使用。5.2.2.2样品的采集与处理
挑选临床发病的MD疑似病鸡，每只鸡无菌采集枸橡酸钠抗凝全血5mL～10mL.加人淋巴细胞分层液，1100r/min离心25min，分离收集淋巴细胞，并用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，用细胞TYKAONT KAca
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维持液稀释成10°个/mL淋巴细胞的细胞悬浮液直接使用或者加15%的二甲基亚砜后保存在液氮（一196℃）中备用。
5.2.2.3接种和培养
取生长良好的DEF单层，弃去维持液，接种0.2mL处理好的淋巴细胞悬浮液，置含5%二氧化碳的培养箱，37℃下吸附1.5h。补充适量维持液继续培养，24h内换液一次，以后每2d～3d换液一次。在培养过程中每日观察CPE产生情况，同时设立不接种样品的空白细胞对照瓶。5.2.2.4收集
在空白细胞对照瓶的细胞生长良好的前提下，将产生广泛CPE（蚀斑形成面积占30%以上）的DEF单层培养瓶中的维持液弃去，用0.01%胰酶消化，加细胞生长液制成细胞悬浮液直接供鉴定用，或者加二甲基亚砜后置液氮（一196℃)中保存备用5.2.3鉴定
5.2.3.1电境观察bZxz.net
将MDV分离物按照常规方法制成超薄切片，用电子显微镜观察病毒的形态和大小。5.2.3.2蚀斑测定
用MDV分离物接种CEF次代单层，培养至72h，用测微器测量蚀斑大小，每份分离物至少测量10个蚀斑，取其平均值作为蚀斑大小的测定值5.2.3.3间接免疫荧光试验
将出现CPE的病毒分离物接种到带生长成单层细胞盖玻片的细胞管内，37℃下吸附1.5h。补充适量维持液，置二氧化碳培养箱中培养观察。当出现明显的病毒蚀斑时，取出管内盖玻片，以冷甲醇（一20C）在4C条件下固定15min，然后用PBS冲洗三次（每次5min），滴加MDV分型单克隆抗体，置湿盒37℃感作90min～120min，用PBS冲洗三次（每次5min），滴加抗鼠免疫荧光抗体，置湿盒37℃水浴感作30min，用含0.05%吐温-20的PBS冲洗三次（每次5min），然后用荧光显微镜检查细胞内荧光出现情况。
5.2.4结果判定
5.2.4.1MDV在电子显微镜下观察时，可见到直径为85nm～100nm近似圆形或者六角形的病毒颗粒或者核衣壳，多数出现在感染的细胞核中，偶见于细胞浆中。5.2.4.2MDV病毒可以在DEF或者CEF单层上产生蚀斑，蚀斑大小一般在1mm之内。血清I型产生的蚀斑较小，血清Ⅱ型产生天合胞体的中等蚀斑，血清血型产生大的蚀斑。5.2.4.3经标准MDV分型单克隆抗体间接免疫荧光染色，在荧光显微镜下病变细胞的核和胞浆中出现清晰闪亮的黄绿色荧光，根据出现荧光的感染细胞所使用的单克隆抗体，可以确定MDV分离毒株为相应的血清型。
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附录A
（规范性附录）
溶液的配制
A.1pH7.40.01mol/L磷酸盐缓冲液的配制磷酸氢二钠（NazHPO4·12H,O)
磷酸二氢钾（KH2PO,）
氯化钠（NaCI）
将上述试剂依次加入容器中，用无离子水或蒸馏水溶至1000mL。2细胞培养液的制备
A.2.1Hanks平衡溶液的配制：
氯化钠（NaCI）
氯化钾（KCI）
硫酸镁（MgSO47H,O4）
氯化镁（MgClz·6Hz0）
双蒸水
氯化钙（CaCl2）
葡萄糖
双蒸水
A.2.2按照上列顺序分别称量A、B液的各试剂，溶解于双蒸水SN/T1454—2011
A.2.3将A液和B液分别于0.069MPa0.075MPa压力下高压灭菌10min或过滤除菌。冷却后，将B液缓慢加人到A液，持续搅拌使之混匀。A.2.4分装于100mL～500mL灭菌瓶中，密封盖紧塞子。贮存4℃或室温下。A.3
细胞生长液的配制
A.3.1顺序无菌称量以下试剂：
5%水解乳蛋白溶液
Hanks平衡盐溶液
犊牛血清
青霉素
链霉素
碳酸氢钠L（NaHCO：（7.5%）
A.3.2将上述试剂溶人72.5mL双蒸水中，并用双蒸水调节总量至100mL，充分混匀。5
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A.4细胞维持液的配制
方法同细胞生长液的配制，只需将特牛血清含量调整为1mL～2mL即可。5pH7.0磷酸盐缓冲液(PBS)的配制A.5
A.5.1所需试剂的准备：
氯化钠（NaCI）
氯化钾（KCI)
氯化钙（CaCl·2H,O）
氯化镁（MgCl·2H,0)
双蒸水
磷酸氢二钠（NazHPO）
磷酸二氢钾（KH,PO,）
双蒸水
A.5.2依次分别称量各试剂，溶解于双蒸水。8.0.g
A.5.3以0.104MPa～0.112MPa高压灭菌A液、B液A.5.4冷却斤，将B液缓慢加人到A液中，搅拌均匀并调节至pH7.0。A.5.5分装于500mL~1000mL灭菌瓶中，经无菌检验后贮存于4℃下备用A.6
含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液的配制A.6.1按照PBS配制方法，去掉其中的氯化钙（CaClz·2H,O)和氯化镁（MgClz·2H,O)，其余试剂依次溶人双蒸水，充分溶解，制成无钙镁PBSA.6.2量取0.5mL吐温-20，加入到1000mL无钙镁PBS中，充分溶解即成为含0.05%吐温-20的PBS。
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中国标准出版社出版
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网址spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16
2011年11月第一版
印张0.75
字数13千字
2011年11月第一次印刷
印数1—1600
书号：155066·2-22613定价16.00元TTKANTKACa
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