【行业标准】 马流行性淋马管炎检疫方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1449—2011
代替SN/T1449—2004
马流行性淋巴管炎检疫技术规范Quarantineprotocolforepizooticlymphangitis2011-05-31发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-12-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准代替SN/T1449—2004《马流行性淋巴管炎检疫方法》。本标准与SN/T1449—2004相比，主要的技术性变化如下：增加了临床诊断（见第4章）；
病理组织学鉴定（见5.4.3)；
-增加了荧光抗体试验（见6.1）；增加了间接血凝试验（见6.3）。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局SN/T1449—2011
本标准主要起草人：朱来华、梁成珠、郑小龙、邓明俊、肖西志、岳志芹、辛学谦、孙涛、王群。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1449—2004。
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1范围
马流行性淋巴管炎检疫技术规范SN/T1449—2011
本标准规定了马流行性淋巴管炎的临床诊断、病原分离鉴定、荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验、间接血凝试验、皮肤过敏反应试验等检疫技术。本标适用手进出口马、骤、驴等马属动物的马流行性淋巴管炎的检疫和诊断。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4789.282003食品微生物学检验染色法、培养基和试剂GB19489实验室生物安全通用要求3生物安全措施
试验环境和防护要求见GB19489。4临床诊断
4.1器材及消毒药物
4.1.1器材：工作服、胶手套、线手套、防护面具、口罩、风镜、反光镜、手电筒、煮沸消毒器、脸盆、耳夹子。
消毒药物：0.1%升汞水、2.5%来苏0.1%新洁尔灭、75%酒精棉球等。4.2检查方法
4.2.1检查者及助手均应穿工作服，戴好乳胶手套、口罩、风镜及防护面具，选择适当位置，对保定好的马进行检查。
4.2.2检查皮肤、皮下组织及黏膜发生结节、脓肿、溃疡和淋巴管索状肿及串珠状结节。4.2.3检查结束，脱掉手套，检查者及助手的手需用0.1%升汞水或2.5%来苏或0.1%新洁尔灭或75%酒精棉球彻底消毒，工作服及用过的器材分别用2.5%来苏尔等浸泡1h，或煮沸10min消毒。检疫现场用10%石灰乳、2%热火碱水或10%~20%漂白粉水溶液消毒。4.3临床特征
4.3.1皮肤（皮下组织）结节、脓肿和溃疡：常见于四肢、头部（尤其是唇部），其次为颈、背、腰、尻、胸侧和腹侧。初为硬性无痛结节，随之软化形成脓肿，破溃后流出黄白色混有血液的脓汁，形成溃疡。继而愈合或形成瘘管。
4.3.2黏膜结节：常侵害鼻腔黏膜，可见鼻腔有少量黏液脓性鼻漏，鼻黏膜上有大小不等黄白色结节，结节逐渐破溃形成溃疡，颌下淋巴结也多同时肿大。口唇、眼结膜及生殖道黏膜，公畜的包皮、阴囊、阴TTKANTKACa
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茎和母畜的阴唇、会阴、乳房等处也可发生结节和溃疡4.3.3淋巴管索状肿及串珠状结节：病菌引起淋巴管内膜炎和淋巴管周围炎，使之变粗变硬呈索状。因淋巴管瓣膜栓塞，在索状肿胀的淋巴管上形成许多串珠状结节，呈长时间硬肿，而后变软化，破溃后流出黄白色或淡红色脓液，形成蘑菇状溃疡4.4判定
根据临床特征（见4.3）可做出初步诊断。进一步确诊应采集病料或血清样品进行实验室检查4.5鉴别诊断
本病的皮肤型容易与鼻疽（鼻疽伯克霍尔德氏菌引起）、溃疡性淋巴管炎（假结核棒状杆菌引起）、孢子丝菌病（电克氏子抱子丝菌引起）和组织胞浆菌病（卖膜组织胞浆菌裹膜变种引起）相混滑（具体鉴别要点参见附录A、附录B）。由于流行性淋巴管炎的临床症状易与其他疾病混淆，因此确诊有待于实验室诊断。
5病原分离与鉴定
5.1材料准备
5.1.1器材
微量移液器、恒温水浴箱、二氧化碳培养箱、普通冰箱及低温冰箱（4℃、一20℃）、离心机及离心管、普通生物显微镜、暗视野或相差显微镜、组织切片机以及废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸。
5.1.2培养基与试剂
真菌琼脂、放线菌酮、氯霉素、固定液、软蜡（熔点为45℃～50℃）、硬蜡（熔点为56℃～58℃），无水乙醇、95%酒精、75%酒精
HE染色液、革兰氏染色液.按GB/T4789.282003中2.2规定配制。5.2样品采集和运送
5.2.1样品采集
从化脓灶和病变淋巴结无菌采集病料。作病原分离时，应将病料放人含抗生素的液体培养基中冷藏，最好尽快进行培养。直接检测时，用棉拭子采集病料后在载玻片上涂片并立即固定。病理组织学检查时，应将病变组织块（包括有病变的和病变周围的正常组织)放入10%中性福尔马林缓冲液中。确诊本病有赖于发现英膜组织胞浆菌假性皮疽变种5.2.2样品运送
在低温条件（2℃～8℃）下，样品尽快（24h～48h内）送往实验室。5.3病原分离培养
取制备好的真菌琼脂培养基试管，无菌操作将采集的样品用接种棒勾取绿豆粒至黄豆粒大小的脓液，或切取结节（淋巴结组织）内壁小组织块，放置培养基斜面下三分之一处，每个样品接种2个试管。将接种好的试管置28℃恒温培养，最初24h应检查是否有杂菌污染。48h后就每天观察，培养4d～15d。若培养超过10d，向试管内加灭菌生理盐水，加量不超过培养物为宜。2
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5.4，病原鉴定
5.4.1菌落鉴定
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28℃恒温培养48h后应每天观察琼脂培养基。观察培养基上有无疑似特征性菌落。在培养基上形成干燥、黄色至暗褐色颗粒状皱缩的菌丝体形菌落。有时形成气生菌丝，但很少见。显微镜下观察培养的菌落.菌丝透明.分隔，呈分枝状，多形态（直径1μm~4μm）)。5.4.2革兰氏染色鉴定
5.4.2.1革兰氏染色按GB/T4789.28—2003中2.2规定操作5.4.2.2结果判定：本菌为革兰氏阳性菌呈紫色。典型的酵母形菌体，多形态性，卵形至球形结构，直径约2um～5um，常单个散在或成丛，菌体周围常可见一晕环（未着色的英膜）。5.4.3病理组织学鉴定
5.4.3.1将采集的病料（2mmX2mm）浸人10倍体积的固定液中固定6h。5.4.3.2将固定好的组织块放入流水中漂洗24h。5.4.3.3放人下列不同浓度的酒精中脱水：75%酒精2h-→85%酒精2h-95%酒精2h-95%酒精Ⅱ2h-100%酒精I2h→100%酒精Ⅱ2h5.4.3.4放人香柏油和二甲苯中透明：香柏油中12h→二甲苯I1h→二甲苯Ⅱ1h。5.4.3.5浸蜡：软蜡中放置40min；硬蜡中放置2h。5.4.3.6将浸好蜡的组织块放入包埋框中用硬蜡包埋，冷却过夜。5.4.3.7将石蜡块切成5μm厚的切片，用干净的载玻片贴片。5.4.3.8脱蜡：依次将切片放入二甲苯-二甲苯-二甲苯各1min，无水乙醇-无水乙醇-70%乙醇各5min，然后用流水冲洗，
5.4.3.9将切片置于蒸馏水中漂洗，浸人苏木素染色液5min~15min。5.4.3.10水洗玻片上多余染液，0.5%~1%盐酸酒精（70%酒精配制）分色片刻。镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止，约数10s。5.4.3.11流水冲洗15min～30min.或者在碳酸锂饱和液中短时间碱化或蓝化.即细胞核呈蓝色。5.4.3.12蒸馏水短洗。
5.4.3.130.1%~0.5%伊红染液染色1min~5min，若着色困难，可在每100mL染液中加人1滴~2滴冰醋酸，使易着色且不易脱色。5.4.3.14依次经70%85%、95%、100%酒精脱水，各级为2min~3min，在95%以下浓度的酒精中伊红易脱色，应适当缩短时间。5.4.3.15二甲苯透明（2次），共约10min。5.4.3.16封片：擦去切片周围多余二甲苯，切勿干凋，迅速滴加适量中性树胶，再加盖玻片封固。5.4.3.17显微镜检查：典型的病理变化为伴有纤维组织增生的化脓性肉芽肿炎症，常见有郎罕氏巨细胞，并可在细胞内、外发现大量的病原体；菌体呈多形性，常略似柠檬的嗜碱性团块，直径2um～5um；在巨噬细胞或巨细胞内，常能见到正在出芽的菌体。5.4.3.18根据典型的病理变化（见5.4.3.17）可做出病原学诊断。3
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6血清学鉴定技术
6.1荧光抗体试验
6.1.1试验器材
恒温培养箱、荧光显微镜、载玻片、盖玻片、玻璃铅笔、接种环、镊子、染色缸。6.1.2试验材料
标准抗原、荧光标记的标准阳性血清、标准阴性血清按说明书使用；异硫氰酸荧光素（FITC）、磷酸盐缓冲液（PBS)。试剂配制见附录C。6.1.3间接荧光抗体试验
6.1.3.1病料采集及保存按5.2操作。6.1.3.2制备抗原片，取病料在载玻片上涂片或用盐水将培养的酵母样菌体乳化制成薄的涂片。6.1.3.3将涂片通过火焰固定。
6.1.3.4用PBS浸洗1min。
加未稀释的被检血清（见附录D)，在37℃湿盒中温育30min。用PBS浸洗3次，每次10min。
加人工作浓度的异硫氰酸荧光素（FITC)标记抗马抗体，在37℃湿盒中温育30min。6.1.3.7
用PBS浸洗3次，每次10min。
用荧光显微镜检查。
6.1.3.10结果判定：将载玻片放在荧光显微镜载物台上，调好光源即可观察。阳性反应者FITC荧光色素呈明亮的黄绿色荧光。阴性反应则没有相应的荧光出现。根据间接荧光抗体试验结果可判定为血清学阳性。
6.1.4直接荧光抗体试验
6.1.4.1先将被检血清中的球蛋白沉淀，然后用盐水将沉淀悬浮并恢复到原体积，最后将血清用FITC标记。
6.1.4.2载玻片上滴加1滴2滴生理盐水，取少量培养的菌丝体菌落颗粒悬浮其中，另取一玻片压碎菌落颗粒，从玻片一端拖涂液体制成薄片。6.1.4.3涂片加热固定。
6.1.4.4用PBS冲洗。
滴加标记血清稀释液，在37℃湿盒中温育60min。6.1.4.6PBS冲洗3次，每次5min。6.1.4.7
荧光显微镜下观察。
结果判定：将载玻片放在荧光显微镜载物台上，调好光源即可观察。阳性反应者FITC荧光色素呈明亮的黄绿色荧光。阴性反应则没有相应的荧光出现。根据直接荧光抗体试验结果可判定为血清学阳性。
6.2酶联免疫吸附试验
6.2.1器材
酶标板、可调移液器、恒温培养箱、电子天平、酶标仪。4
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6.2.2试剂
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抗原、阴性血清、阳性血清、酶标抗体、包被缓冲液、洗涤缓冲液、稀释液、底物缓冲液（使用前配制）、终止液。
6.2.3操作方法
6.2.3.1用真菌琼脂试管接种菌丝体菌体，于26℃下培养4周，取3个菌落加50mL无菌PBS研碎，稀释成1：100悬液，以每孔100L量包被酶标板，放置4℃C过夜温育。6.2.3.2用洗涤液洗涤酶标板3次，每次3min。6.2.3.3每孔加人100μL封闭液.于23℃~25℃轻轻振荡在湿盒中温育30min6.2.3.4用洗涤液洗板3次，每次3min。6.2.3.5将待检血清（见附录E)用稀释液1：40稀释，加人100uL，将酶标板置湿盒中37℃振荡温育1h。每个血清稀释度做2个平行对照，同时设阳性血清对照和阴性血清对照。6.2.3.6用洗涤液洗板3次，每次3min。6.2.3.7取1：800倍稀释的过氧化物酶标记的山羊抗马IgG，每孔加人100μL，于23℃～25℃轻轻振荡温育30min。
6.2.3.8用洗涤液洗板3次，每次3min。6.2.3.94
每孔加人100μL用底物溶液，温育60min。6.2.3.10
每孔加入100μL终止液，用酶标仪在波长405nm处判读结果。6.2.4，结果判定此内容来自标准下载网
式中：
结果计算见式(1)：
S/P=(SoD-NC)/(PCx-NC)
样品OD平均值；
阴性对照OD平均值；
阳性对照OD平均值。
6.2.4.2当S/P≥0.5则判为ELISA抗体阳性6.2.4.3
当S/P<0.5，则判为ELISA抗体阴性根据ELISA结果判定可初步判定为血清学阳性。6.3间接血凝试验
6.3.1器材
台式离心机、超声破碎仪、水浴锅、可调移液器和试管等。6.3.2试剂
真菌琼脂、生理盐水、绵羊红细胞（RBC）、酸、抗原和阳性血清等。6.3.3操作方法
6.3.3.1菌体在真菌琼脂上繁殖8周，刮取5个菌落磨碎，悬浮在200mL生理盐水中，超声波处理20min。过滤除去残留的菌丝体，滤液作1：160稀释6.3.3.2洗涤健康绵羊红细胞（RBC)，用操酸处理（见附录D)，洗涤，配成1%细胞悬液：5
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6.3.3.3取稀释的抗原与酸化的RBC混合，37℃水浴温育1h，离心收集血球泥，用生理盐水洗3次配成1%红细胞悬液。
6.3.3.4被检血清56℃灭能30min，再用等体积的RBC吸收。6.3.3.5试管中加人稀释血清（0.5mL)以及0.05mL抗原吸附的化RBC。6.3.3.62h和12h时判读凝集情况。6.3.4结果判定
红细胞分散在管底呈颗粒状，判为凝集。6.3.4.1
6.3.4.2红细胞沉淀在管底中央，判为凝集阴性。6.3.4.3根据间接血凝试验结果判定可初步判定为血清学阳性。6.4皮肤过敏试验
6.4.1材料
6.4.1.1试剂：病原菌、PPLO培养基、生理盐水、葡萄糖、甘油、丙酮、75%酒精棉球或0.1%新洁尔灭棉球。
6.4.1.2器材：1mL注射器、剪毛剪、聚苯乙烯圆盘，游标卡尺6.4.2假性皮疽组织胞浆菌（H.farciminosum）试验6.4.2.1菌体在真菌琼脂繁殖8周，刮取5个菌落磨碎，悬浮在200mL生理盐水中，超声波处理20min。余留的菌丝体成分滤掉，滤液1：100稀释。稀释液应在真菌琼脂上，于26℃下培养4周确证无菌。
6.4.2.2用剪毛剪剪去被检马左侧或右侧颈部三分之一的中央部位的被毛，面积约5cmX5cm。消毒后在动物颈部皮内注射0.2mL菌素。6.4.2.3注射后48h～72h检查注射部位局部是否有硬结和隆起6.4.3浓缩皮疽菌素（histofarcin）试验6.4.3.1将菌丝体接种到漂浮在250mL含2%葡萄糖、2.5%甘油的PPL0培养基上的聚苯乙烯圆盘内，于23℃～25℃下培养4个月。6.4.3.2培养物无菌滤液与丙酮2：1混合，4℃下作用48h。6.4.3.3弃去上清液，剩余部分待丙酮蒸发掉，获得沉淀物。6.4.3.4将沉淀物用蒸馏水稀释恢复至原来体积的1/10。6.4.3.5用剪毛剪剪去被检马左侧或右侧颈部三分之一的中央部位的被毛，面积约5cmX5cm。消毒后在动物颈部皮内注射抗原0.1mL6.4.3.6于注射后24h、48h、72h检查注射部位局部是否有硬结和隆起。6.4.4结果判定
皮肤厚度增加大于4mm或肿胀面积大于8cm2，判为阳性。6.4.4.1
6.4.4.2皮肤厚度增加小于3.0mm或肿胀面积小于4.0cm判为阴性。6.4.4.3皮肤厚度增加在3mm~4.0mm之间或肿胀面积在4cm2～8.0cm之间，判为可疑。6.4.4.4可疑的马匹间隔一周在对侧颈部再进行一次检测，两次疑似者判定为阳性。6.4.4.5
根据皮肤过敏试验结果可判定为变态反应阳性。TTKANTKACa
附录A
（资料性附录）
马流行性淋巴管炎概述
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马流行性淋巴管炎（epizooticlymphangitis）是马和马科动物的一种慢性接触传染性疾病。其临床特征是形成化胶性、溃疡性、扩散型、肉芽肿性和多灶性皮炎和淋巴管炎，最常见于四肢未端、胸壁和颈部，也可在眼脸结膜部位形成溃疡性结膜炎，或者形成多灶性肺炎。本病曾被称作假性皮疽（pseudofarcy）或假鼻疽（pseudoglanders）。另一病名为马组织胞浆菌病，这可能是本病更准确的病名，因为并不是所有的临床病例都出现明显的淋巴管炎。病型似乎主要取决于感染途径。皮肤型是由于损伤的皮肤接触到了污染的土壤；结膜炎型是由于家蝇或整蝇叮咬而传播的。肺型不常见，通常认为由于吸人病原体后发生的。在所有情况下，病变都呈典型的结节状和肉芽肿。病原体一且侵入，则由局部扩散，然后经淋巴管扩散。淋巴管增粗，似绳索状，同时形成化服性结节。局部淋巴结肿大、发炎。马流行性淋巴管炎的病原体为荚膜组织胞浆菌假性皮疽变种（Istoplasmacapsulatumvar.far-ciminosum)是一种两型真菌：土壤中呈菌丝型，病变部位以酵母型多见。过去把假性皮疽组织胞浆菌（Histoplasmafarciminosum）当作一种独立的真菌描述，现在经过进一步鉴定发现它们的菌丝型和酵母型两者的形态十分相似，从而改变了归属，认为它是荚膜组织胞浆菌（Histoplasmacapsulatum）的个变种。在抗原性上，荚膜组织胞浆菌假性皮疽变种与荚膜组织，胞浆菌荚膜变种不能区别根据渗出物涂片或病变组织学切片中病原的形态特征检查，可对病原作出鉴定。在典型病变中有大量的酵母样菌体出现，其结构呈卵圆形或球形等多种形态，直径大约2um～5um，位于巨噬细胞和巨型细胞的胞外和胞内。经革兰氏染色或苏木紫和伊红染色，在菌体周围常有一晕环。在25℃～30℃有氧条件下培养形成菌丝型菌体，但生长缓慢。可培养该菌的培养基有真菌琼脂、沙保劳（Sabouraud)氏葡萄糖琼脂、脑-心浸液琼脂及PPLO营养琼脂等多种培养基。TYKAONTKACa
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B.1马鼻疽
附录B
（规范性附录）
马流行性淋巴管炎的鉴别诊断要点在呼吸道和肺引起结节和溃疡，也会出现皮肤型鼻疽，急性型，病初表现体温升高，呈不规则热（39℃～41℃）和颌下淋巴结肿大等全身性变化；慢性型，临床症状不明显，有的可见一侧或两侧鼻孔流出灰黄色脓性汁，在鼻腔粘膜常见有糜烂性溃疡，有的在鼻中膈形成放射状斑痕。病理变化主要为急性渗出性和增生性变化。渗出性为主的病变见于急性异疽或慢性异疽的恶化过程中；增生性为主的病变见于慢性疽。
B.2溃疡性淋巴管炎
病原为伪结核棒状杆菌（Corynebacteriumpseudotuberculosis），该菌是引起人和多种动物共患的慢性传染病的重要病原之一，主要引起羊干酪性淋巴绪炎、骆驼脓肿、马溃疡性淋巴管炎和人化脓性淋巴管炎。动物多由皮肤破伤感染，有的可因摄食污染的饲料而感染。该病的发病特征是淋巴结肿大，呈脓性干酪性坏死；有的还可能在肺、肝、脾和子宫角发生大小不等的结节，内含淡黄白色干酪样物质。呈现消瘦，生产性能下降，严重者死亡。由于该病发病缓慢，致死率低，所以常被人们忽视，但它却又是世界公认的难以防治的传染病之一，一且侵人畜群则很难彻底清除，给畜牧业的发展造成较大危害。B.3孢子丝菌病
抱子丝菌病是由申克抱子丝菌引起人及动物的皮肤及其附近淋巴系统的慢性感染性疾病，偶可播散至全身而引起多系统损害。申克孢子丝菌为病原菌，在自然界为腐物寄生菌，广泛存在于柴草、芦苇、粮秸、花卉、苔藓、草炭、朽木、土壤和沼泽泥水中。孢子丝菌病为人畜共患疾病，其中马为本菌的自然宿主；本病的流行主要是地方性小范围流行B.4组织胞浆菌病
临床上表现为肝、脾、淋巴结肿大、持续高热和多器官受损·最后全身衰竭oo
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C.1真菌琼脂培养基
真菌琼脂
（规范性附录）
培养基和试剂的配制
补加蒸馏水至1000mL，121℃高压灭菌15min。然后加人放线菌酮0.5g，氯霉素0.5g，倒人试管或平皿中，放人4℃备用。C.2
0.2mol/L磷酸氢二钠（NazHPO）溶液SN/T 1449—2011
称取71.63g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H,O）.加蒸馏水溶解，定容至1000mL。0.2mol/L磷酸二氢钠（NaH,PO.）溶液称取31.20g磷酸二氢钠（NaH,PO,·2H,O)，加蒸馏水溶解，定容至1000mL。C.40.1mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液0.2mol/L磷酸氢二钠（NazHPO,）0.2mol/L磷酸二氢钠（NaH,PO,）蒸馏水
洗涤缓冲液（PBS-T)
PBS1000mL.吐温-200.5mL.混匀。5封闭液
牛血清白蛋白（BSA)3g～5g溶于100mL的PBS中。C
稀释液（PBS-T-BS)
PBS-T100mL，牛血清白蛋白（BSA)2.0g，混勺。C.8
3底物溶液
甲液：柠檬酸（C,H.O，·H.0）21.01g，加蒸馏水至1000mL。乙液：磷酸氢二钠（NaHPO：12H,O）71.64g，加蒸馏水至1000mL。9
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甲液与乙液按9.7：10.3的比例混合成pH5.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液底物溶液在临用前按如下比例配制：ABTS
柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH5.0）3%H.02
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