【行业标准】 进出口粮谷中T-2毒素的检测方法 酶联免疫吸附法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2676—2010
进出口粮谷中T-2毒素的检测方法酶联免疫吸附法
Determination of T-2 in cereals for import and export-Enzyme-linked immunosorbentassay2010-11-01发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-05-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局，本标准主要起草人：孙静克、鲍蕾、张艺兵、吕宁、吴振兴、金莹、田娟、许艳丽。SN/T2676—2010
1范围
进出口粮谷中T-2毒素的检测方法酶联免疫吸附法
本标准规定了进出口粮谷中T-2毒素的酶联免疫吸附检测方法，本标准适用于大麦、小麦、高粱、玉米中T-2毒素的检测。2规范性引用文件
SN/T2676—2010
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3方法提要
本方法的测定是基于竞争性酶联免疫反应，用甲醇/水振荡提取粉碎样品中的T-2毒素。处理后样品中的T-2毒素与T-2毒素酶标记物竞争结合至包被在微孔板上的抗体。通过洗涤除去微孔上未结合的T-2毒素与T-2毒素酶标记物，然后加人反应底物，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中的T-2毒素含量。
4试剂和材料
除注明外，所用化学试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1T-2毒素检测试剂盒（参见附录A）。4.2甲醇。
4.3甲醇-水提取液：用甲醇和水以7：3的比例配制成提取液备用。4.4T-2毒素标准品：纯度大于等于98%。4.5T-2毒素标准品溶液的配制：用乙睛作为溶剂配制成200ug/mL的储备液，于一4℃条件下保存。4.6pH值为7.2的样品稀释用磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）：分别称取0.55g磷酸二氢钠（NaH,PO，H,O).2.85g磷酸氢二钠（Na2HPO。：2H2O)和9g氯化钠，用水溶解并定容至1L。如果毒素含量较高，需要更高倍稀释时（大于1：7）应向此缓冲液中加人10%的甲醇溶液，以保证甲醇溶液的浓度为10%。
仪器和设备
5.1天平：感量0.01g。
5.2均质器。
5.3涡旋混合器。
5.4微量移液器：5μ~50μ，10μ~100μL，0~10001
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5.5多通道微量移液器：50μL~300uL。5.6容量瓶：10mL，1000mL。
5.7酶标仪。
5.8粉碎机。
5.9离心机：5000r/min。
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
将样品按四分法缩分至1kg，全部磨碎至颗粒可通过20目筛大小，混勾，均分成两份作为试样，分别装入清洁的容器内，密封，并标明标记。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
6.2试样的保存
将试样于一5℃以下避光保存。
7分析步骤
7.1提取
称取25g试样（精确到0.01g），加入125mL甲醇-水提取液（4.3），均质1min~2min，5000r/min离心10min。离心后取50μL滤液加入300μL样品稀释液，混匀。取50μL进行酶联免疫测定，最后稀释倍数为35。高浓度的样品，毒素含量如超出标准曲线范围，可进一步稀释，直至样品中毒素浓度在标准曲线范围以内。
7.2测定条件
7.2.1操作条件
所有操作应在室温下（20℃～24℃）进行，T-2毒素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温（20℃～24℃）后方可使用。
7.2.2洗板条件
人工洗涤次数5次以上，每次加人洗涤液量为250uL，自动洗板可以预定5次7.2.3酶标仪测定条件
酶标仪测定波长为450nm。
7.3测定步骤
7.3.1将测定需用的微孔条插人微孔架·记录标准液和样液在微孔架上的位置。7.3.2吸取50μLT-2毒素标准液（浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6ng/mL)和样液至各微孔。7.3.3吸取50LT-2毒素酶标记物至各微孔，均匀混合，依次加人50LT-2毒素抗体，混合，以封口膜将微孔覆盖防止试液挥发，于22℃～25℃黑暗避光处孵育1h。7.3.4倒出孔中液体，以250μL蒸馏水反复清洗微孔，重复操作3次以上，将微孔倒置在吸水纸上拍打数次，以保证完全除去微孔中洗液。2
7.3.5迅速加人100L底物至各微孔，于22℃～25℃黑暗避光处孵育30min。SN/T2676—2010
7.3.6孵育完毕后加入100μL反应停止液至各微孔，充分混勾，上酶标仪测量并记录每个微孔试液450nm波长处的吸光度值（加人反应终止液后应在30min内读取吸光度）。7.4平行试验
按以上步骤，对同一标准溶液、同一样品溶液均应进行平行试验测定。7.5空白试验
除不称取试样外，均按上述步骤进行。7.6阳性质控
每次测定均应做一个添加自配T-2毒素标准品溶液（4.5）的监控样品。以确定实验过程的操作准确性。
结果计算
标准品和样品的OD平均值除以零标准（A1、A2)的平均OD值，再乘以100.计算出各标准液和样品的百分比吸光度值。零标准为100%（最大吸光度值），其他OD值为最大吸光度值的百分数。以吸光度的百分比值（B/B）为纵坐标（%），T-2毒素标准溶液浓度（ng/mL）的对数值为横坐标绘制标准工作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的T-2毒素浓度后，结果按式（1）进行计算。X=cX×1000
mx1000
式中：
X样品中T-2毒素的残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；从标准工作曲线上得到的样品中T-2毒素浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V一样品溶液的最终定容体积，单位为毫升（mL)；m
样品溶液所代表的最终试样质量，单位为克（g）。也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算。注：计算结果扣除空白值，所得结果保留一位小数。确证试验
如被测样品中T-2毒素含量的值大于限量要求时，应用其他方法进行确证。10本方法测定低限、回收率、精密度10.1测定低限
本方法的测定低限为3.5ug/kg
10.2回收率
本方法T-2毒素添加浓度和回收率实验数据：添加量为3.5μg/kg时，回收率为80.9%～90.0%；添加量为14g/kg时回收率为89.3%~96.4%；...(1)
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添加量为56μg/kg时，回收率为90.4%～97.0%；添加量为100μg/kg时，回收率为98.5%~106.4%。10.3精密度
本方法在大麦中的精密度为7.0%~11.3%，在高梁中的精密度为5.6%～11.4%，在小麦中的精密度为4.5%~15.3%.在玉米中的精密度为8.2%~16.0%。试剂和组成
附录A
（资料性附录）
德国R-Biopharm试剂盒！
包被有抗体的微孔条.12条×8孔。T-2毒素标准液（浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6ng/mL）。T-2毒素酶标记物。
T-2毒素抗体。
底物。
样品稀释缓冲液。
反应停止液。
试剂盒应在2℃~8℃避光条件下保存。A.2
标准校正曲线
标准校正曲线见图A，1。
T 2 Toxin/(格/hg)
标准校正曲线
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1）给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，需经实验评估后使用这些等效产品。
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Foreword
This standard was proposed by and is under the charge of the certification and accreditation Administrationof thePeople'sRepublic of ChinaThis standard was drafted by Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine BureauofthePeople'sRepublicofChina
The main drafters of this standard are Sun-jingke,Baolei,Zhang-yibing,Luning,Wu-zhenxing,JinyingTianjuan,Xu-yanli
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Determination of T-2 in cereals for import and export-Enzyme-linkedimmunosorbentassayScope
This standard specifiesthe method of sample preparation and determinationbyELiSA method of T-2toxinincerealsforimportand export.This standard isapplicabletothe fast determination of T-2toxin inbarley,wheat,sorghum and corn.2 Normative references
The following normative documents contain provision which,through reference in this text,constitutesprovisionofthisstandard.Fordatedreferences,subsequentamendments(excludecorrection)to,orrevisions of.any ofthesepublications donotapply.Howeverparties to agreements based onthis standard areencouraged to investigatethe possibility of applying the most recent editions of thenormative documents indicated below.For undated references.the latest edition of the normativedocumentreferredtoapplies
GB/T6682Waterforanalyticallaboratoryuse-Specificationandtestmethods3Principle
The basisof the test istheantigen-antibody reaction.The microtiter wells are coated withcaptureantibodies directed against anti-T-2 toxin antibodies, The standards,the samples and the enzymeconjugate are added to the microplate wells. During the first incubation,there is a competitionamongthefreemolecules,likeT-2,thestandardsorsamplesandtheenzyme(enzymeconjugate)forthe binding sites of the anti-T-2 antibody adsorbed to the solid phase. After the washing step,anyunbound molecule is removed The bound enzyme activity is determined by adding an amount ofchromogen substrate.The additionof the stop reagentleads to a colorchange fromblue toyellow.Theabsorbance,measuredbyamicroplatereader(450nm)is inverselyproportionaltotheT-2toxinconcentrationinthesample.
4Reagentsandmaterials
Unless otherwise specified,all the chemical reagents shouldbeA.Rgrade,water isthefirstgrade7
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waerprescrikedinGB/T6682
Enzyme immunoassaykit forthequantitativeanalysis of T-2 see annexA4.2Methanol.
Methanol-water(7：3)extractsolution4.4
T-2standard：Purity≥98%
4. 5 T-2 standard solution:Dilute with acetonitrile to prepare a standard stock solution of 200 μg/mlinconcentration
4.6PBSbuffer.pH7.2:weigh0.55gNaHzPO4·HzO.2.85gNa2HPO。·2H,Oand9gNaCl,fillupto1000mLwithmethanol/distilledwater10/90(V/V).AthighT-2toxinconcentrationsthe1:7dilu-ted extract solution must be further diluted.1:10 with PBS buffer containing 10%methanol.5
Apparatus and equipment
Balance：acuratein0.01g
Homogenizer.
Vibrator.
5.4Micro-pipetteswithdisposableplastic tips:5μL~50μL,10μL~100μL.0μL~1000μL.5.5
Multi-channelpipetteswithplastictips:50uL~300uL.5.6
volumetricflask:10mL,1000mL
ELisAreaderequippedwitha45onmfilterGrinder.
Centrifuge:5000r/min.
Preparationand storageof sample6.1Preparationof sampleextractionReducethesampleto 1kgbyquartering,Grindwiththegrinder toletall passthrougha20mesh8
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sieve.Mix thoroughly and divided into two equal portions. Place in clean sample containers,sealandlable. In thecourse of sampling preparation,precautions should be taken to avoid contamination oranyfactorsthatmaycausethechangeofresiduecontent.6.2Storage of sample
Storesamplebelow-5℃andkeptawayfromlightAnalysisprocedure
7.1Extractionprocedure
Weigh25gsample(acurateto0.01g)andadd125mLmethanol-watersolution(4.3),shakervigorously1min~2min.and centrifuge5000r/minfor10 min.Filter the extract over paper filter.Add300μLsampledilutionbufferto50μLfiltrate.Use50μLfiltrateperwell inthetest.AthighT-2toxin concentrationsthatbeyond the range of standard curve,the diluted extract solution must befur-ther diluted.
7.2Test condition
7.2.1Operation conditior
All the operation should be done at room temperature(20 ℃ ~24 ℃).The reagents should bebroughe up to ambient temperature(20 ℃ ~24 ℃) before starting the test.7.2.2TheworkconditionofwashmachineManual work:All the wells must be washed manuallymore than5times.Each time inject 250 μlwash solutionwith multichannel micropipette.Automatismwork:All the wells should be washed5 times by the wash machine.7.2.3TheworkconditionofmicroplatereaderThemicroplatereadershouldbeusedat450nmfilter.7.3 Determination
7.3.1Insert a sufficient number of wells into the microwell holder.Record standard and sample po.sitions.
7.3.2Pipet50μLof eachstandard(0.0.1.0.2、0.4、0.8、1.6ng/mL)andsampledilutiontoseparatewells;useanew pipettetipfor eachstandardor sample.9
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7.3.3Add 50 μL of enzyme conjugate to each well.Add 50 μL of the anti-T-2 toxin antibody solu-tiontoeachwell.Mixgentlybyshakingtheplatemanuallyandincubatefor1hat22C~25inthedark.
7.3.4Pourthe liquidoutof thewellsandtapthemicrowell holderupsidedownvigorouslyagainstabsorbentpaperto ensurecompleteremovalof liquidfromthewells.Fill all thewellswith250μLdistilled water and pour out the liquid again. Empty the wells again and remove all remaining liquid.Repeatthewashing steptwomoretimes.7.3.5Add100 μL of substrate/chromogen to each well.Mixgentlybyshaking theplatemanuallyandincubatefor30minat22℃~25℃inthedark.7.3.6Add100μLof thestop solutiontoeachwell.Mixgentlybyshakingtheplatemanuallyandmeasuretheabsorbanceat450nm.Readwithin10minutesafteradditionofstopsolution7.4Parelleltest
Followingthe above steps,the standardsand samplesolutions also shouldbemeasured at the sametime for parallel test.
7.5Blanktestwww.bzxz.net
Thetest shouldbedonefollowingtheabovesteos exceptforaddingsamples.7.6Positivemonitoring
Analysisarecoveries fortified atmaximumresidue limit (MRL)levelusingblanksample eachtest.Calculating the result
TheODvaluesof thestandardsandthesamples(meanvaluesof theduplicates)aredividedbythemeanODvalueofthezerostandard(wellsA1andA2)andmultiplyby100（B/B.);thezerostand-ard is thus made equal to 100%(maximal absorbance)and the other OD..Values are quoted in per-centagesof the absorbance.Enter the B/B。value calculated for each standard ina semi-logarithmicsystem of coordinates against the standard T-2 concentration;draw the standard curve;Interpolatethe corresponding concentration from the calibration curve;Calculate the concentrations of T-2 inthesamplesaccordingtoformula(1)：X=C×V×1000
m×1000
XtheconcentrationofT-2inthesamplesunitinμg/kg10
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