【行业标准】 食品中常见致病菌检测

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2641—2010
食品中常见致病菌检测
PCR-DHPLC 法
Detection of pathogen infoodPCR-DHPLCmethod
2010-11-01发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-05-01实施
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T2641-—2010
本标准主要起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国江西出人境检验检疫局、中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、北京盈九思科技发展有限公司：
本标准主要起草人：曹际娟、郑秋月、徐君怡、黄晓蓉、耿丽梅、孙哲平、王旭、于畅、邵碧英、郑晶、杨春华、王振国、高晓博。
1范围
食品中常见致病菌检测
PCR-DHPLC法
本标准规定了食品中沙门氏菌等3O种致病菌的PCR-DHPLC检测方法。本标准适用于食品中沙门氏菌等30种致病菌的快速检测。SN/T2641—2010
注：30种常见致病菌包括：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、嗜热弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏菌（0157：H7、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠致病性大肠埃希氏菌、肠侵袭性大肠埃希氏菌、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、梅氏弧菌、嗜水气单胞菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽孢杆菌、溶血性链球菌、布鲁氏杆菌、乳酸杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌。2
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403
实验室质量控制规范食品分子生物学检测3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA（deoxyribonuleicacid）：脱氧核糖核酸dNTP（deoxyribonucleosidetriphosphate）：脱氧核苷酸三磷酸DHPLC(denaturinghighperformanceliquidchromatography）：变性高效液相色谱PCR（polymerasechainreaction）：聚合酶链式反应Taq（Thermusaquaticu）：水生栖热菌TEAA：三乙基铵酷酸盐
生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。应按照GB19489中的有关规定执行。
5废弃物处理和防止污染的措施
5.1检测过程中的废弃物需经121℃高压火菌处理至少30min后再弃置。5.2检测过程中防止交叉污染的措施参照标准GB/T27403执行。1bzxZ.net
SN/T2641—-2010
6原理
DHPLC分析技术是应用离子对反相液相色谱原理对DNA片段进行分离。离子对采用三乙基胺醋酸盐缓冲溶液（TEAA），核苷酸片段分子中带负电荷的磷酸根基团与TEAA分子中带正电荷的氨基发生静电作用相互吸引，同时TEAA分子中的三个乙基与固定相C18表面的烷基发生疏水作用力而相互吸引，通过流动相中的乙睛的梯度洗脱达到将不同大小的核昔酸片段分离。7试剂和材料
应齿色谱纯。水为灭菌超纯本，符合GB/T6682中一级水的规格。除另有规定外，所有试剂纯度！所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装7.1TagDNA聚合酶。
7.2dNTP:dATP,dTTP,dCTP,dGTP
7.310×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCi(pH8.4).200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。7.4引物：引物序列见附录表A.1。7.5TE溶液。
10%SDS。
蛋白酶K(20mg/mL)。
氯化钠（NaCI）：5mol/L和
10% CTAB。
三氯甲烷。
异戊醇。
异丙醇。
70%乙醇。
DHPLC缓冲液：缓冲溶波
溶液B为50mLTEAA和250
主要仪器和设备
8.1PCR仪。
8.2DHPLC仪。
8.3高速离心机：离心转速18000gPCR超净工作台。
和250江艺属
混合，加水定容至1000mL；缓冲主容至1
缓冲溶液D为75%乙睛。
微量可调移液器和灭菌吸头：2μ、10μ、100μ、200μ、1000μL，灭菌PCR反应管。
9方法提要与检测程序
9.1方法提要
本方法利用DHPLC非变性条件下的DNA分离技术，灵敏地检测PCR扩增产物进行细菌鉴定分析，不同的细菌显示特异的DHPLC吸收峰，从而对食品中的致病菌进行快速检测。2
9.2检测流程
致病菌PCR-DHPLC检测流程见图1样品制备
增菌肉汤或待鉴定的菌株
细菌DNA的提取
PCR护增
阴性结果
操作步骤
结果报告
可囊阳性结果
传统方法
变性高效液相色谱法检测致病菌流程图样品制备、增菌培养和分离
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参照附录B中的相关国家标准、行业标准或国际权威标准方法进行增菌和分离培养。10.2模板DNA的制备
10.2.1增菌液模板DNA的制备
取10.1中培养的相应致病菌增菌液（需二次培养的则取二次增菌液）1.5mL，加到1.5mL无菌离心管中，13000g离心1min；吸弃上清液，取沉淀，加567μLTE溶液（pH8.0），悬浮，加30μL10%SDS和3μl.蛋白酶K（20mg/ml.），混匀，37℃温浴1h；加100μL氯化钠（5mol/L），混勺，加80μLCTAB/NaCI溶液（10%CTAB和0.7mol/L氯化钠），混匀，65℃温浴10min；加等体积三氯甲烷/异戊醇（体积比为24：1），混勾，13000g离心10min：取上清液，加等体积酚/三氯甲烷/异戊醇（体积比为3
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25：24：1），混匀，13000g离心10min：取上清液，加0.6倍体积异丙醇，轻轻混匀，13000g离心10min：取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加100μLTE溶液（pH8.0）溶解，此即为DNA溶液。若不能立即检测，可保存于--20℃备用。按同样方法制备阳性对照菌株和阴性对照菌株的增菌液模板DNA。也可使用商业化的DNA提取试剂盒并按其说明制备模板DNA10.2.2可疑菌落模板DNA的制备
挑取10.1中分离到的可疑菌落或菌体，或其传代培养液1.5mL，按照10.2.1步骤制备模板DNA以待检测。也可使用商业化的DNA提取试剂盒并按其说明制备模板DNA。10.3PCR扩增
10.3.1反应体系体积为25μL:10×PCR缓冲液2uL，正义引物和反义引物（10μmol/L）各1μL、dNTP(10mmol/L)2μL、TagDNA聚合酶（5U/μL)0.2μL、水16.8μL、模板DNA（(10ng/μL~50ng/μL)2μL
10.3.2反应条件：94℃预变性3min94℃变性60s60℃退火60s，72℃延伸60s，进行35个循环；72℃延伸7min，4℃保存反应产物。10.3.3将PCR产物进行DHPLC分析。注：PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。10.4DHPLC检测
10.4.1DHPLC分析条件
DHPLC分析条件如下：
a）色谱柱：PSDVB&CiDNASep色谱柱（4.6mmX50mm，粒度3μm）：b）柱温：50℃；
流动相：缓冲溶液A浓度为50.2%，缓冲溶液B浓度为49.8%：c
流速：0.9ml/min；
分析片断设计：起始碱基数：扩增目标的预期片段减去100bp：终止碱基数：扩增目标的预期片e
段加上100bp；
检测器：荧光检测器（光源：150WXenon灯：激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s）；
g）上样量：PCR产物5μL~10μL。10.4.2DHPLC分析步骤
10.4.2.1将装有PCR产物的反应管放置在DHPLC金属板的微孔中。10.4.2.2登录DHPLC分析系统，按照10.4.1设置DHPLC分析条件，建立检测程序并运行。10.5质控对照设置
检测过程中应分别设阳性对照和阴性对照。阳性对照为目标致病菌的标准菌株，阴性对照为非目标致病菌的标准菌株。
11结果及判断
质控标准
11.1.1阴性对照：无吸收峰出现。4
2阳性对照：出现典型的PCR产物吸收峰，且峰吸收值大于3mV。11.1.2
不符合上述对照质控标准的视为无效。11.1.3
结果判定和报告
以沙门氏菌为例，DHPLC检测图谱示例，参见附录C：a)
SN/T2641—2010
检测样品无扩增吸收峰出现，可判定样品结果为阴性，直接报告末检出×××致病菌；检测样品出现典型的PCR产物吸收峰，且吸收峰值大于3mV时，可判定该样品×××致病b)
菌为可疑阳性；
检测样品出现典型的PCR产物吸收峰，但吸收峰值小于3mV时，建议调整PCR扩增参数重新进行检测。重做结果吸收峰值仍小于3mV则为×××致病菌阴性，否则为×××致病菌可疑阳性；
对于×××致病菌可疑阳性结果，应参见附录B中的相关经典检测方法做进一步的生化鉴定d)
和报告。
SN/T26412010
基因名称
16SrRNA
16SrRNA
16S-23S
附录A
（规范性附录）
食品中常见致病菌PCR-DHPLC检测所用引物序列食品中常见致病菌PCR-DHPLC检测所用引物序列表A.1
致病菌名称
沙门氏菌
志贺氏菌
金黄色葡萄球菌
小肠结肠炎耶尔
单核细胞增生李斯
特氏菌
空肠弯曲菌
嗜热弯曲菌（空
曲菌和结肠弯曲菌
肠出血性大肠埃希
氏菌O157：H7
产肠毒素大肠境
肠致病性大肠埃希
肠侵裘性大肠埃希
腋崎肠杆菌
溶血性链球菌
副溶血性弧菌
引物序列
5-tce teg cac cgt canagg aacc-3gttet tgaccgccttteegataeeg
5-gccggtca
aaagaa
5-aataceg
g-3”
cagcag3”
S-ent ettetg cgu gta acg te-3?eaatgt
ctteggcgcgaateg
5'-gccgtcgatgatttg aacttcatc-3aataaag
gaggta gai
cta gctugc tga t-3
tataag
Ccttagg
ctg ett
'-attgc
5°-gca caegca
5-tcette8to
ttgagta
cct ttg-3\
catcgt
tcctcagte-3
fttcaatg
caa att catgaR
5'-gga atc aga cgc aga ctg gta gt-3'5'-ctg gat ggt atg gtg agg-35'-gga ggc caa caa tta ttt cc-3'5'-ggg ttg tct gcg aaa gcg aa-3*5'-gte ttc gtg ctg cga gtr tg-3'5'-ccc cra cag ata cac ggc ta-3*5'-ggg gtt cca tet cgt atg aa-3'5'-aaa geg gat tat gca gaa gca ctg 3*5'-get act ttc tag cat'ttt cte tgc 3*预期片段大小
基因名称
vvhB/vvhA
eollagenase
hemolysin
16S-23S
16SrRNA
blaA/blaB
致病菌名称
霍乱弧菌
创伤弧菌
溶藻弧菌
拟态弧菌
河流弧菌
梅氏孤菌
蜡样芽孢杆菌
肉毒梭菌
产气英膜梭菌
布鲁氏杆菌
肺炎克雷伯氏
乳酸杆菌
绿脓杆菌
嗜水气单胞菌
普通变形杆菌
奇异变形杆菌
表A.1（续）
引物序列
5'-cac caa gaa ggt gac tt att gig-3'5'-gaa ctt ata acc acc cgc g-35'-ccg cgg tac agg ttg gcg ca-35'-cgc cac cca ctt tcg ggc c-3\Geccsea ceg ett act tn ont tg-35 ung gga aag igealc agengc cgegta-3
-cga ccatt
eccacat
atacgg
cgac-3\
agt aag act e-3
aag ctg ctc tt-3'
5ngca aet atc cga cag cac car t-35aneage gitgaa nugagt gg-3
5.-ttgtaactato
at(e/t
5°-tgg
5gat gie
g)at-3
Dccccaekaktalg/
BtReta8
eta-32
caatattc
tcaggt
SN/T2641—2010
预期片段大小
t(c/D(c/t)tt(c/aa3*
ttcgaaa
arc gttgat gcc
act aaa caa
5'-ctt gta cac acc gcc cgt ca-3'5'gac aac gcc ctc agc arc acc agc-35*-cgc tgg ccc att cgc tcc agc gct-35'-gaa agg ltg atg cct aat acg ta-3*5'-cgt gct ggc aac aaa gga cag-35'-gat ggc aag tac aag tua g-3*5'-gac gct gag att gac cta-3\5'-caa cgt gag alt agt ggtgu-3\5'-ctg cit ata agt tca caatt aag tg-3'223bp
SN/T2641—2010
附录B
（资料性附录）
标准清单
GB4789.4食品安全国家标准食品卫生微生物检验GB/T4789.5
GB/T 4789.6
GB/T 4789.7
GB/T4789.8
GB/T 4789.9
GB4789.10
食品卫生微生物检验志贺氏菌检验食品卫生微生物检验
食品卫生微生物检验
食品卫生微生物检验
食品卫生微生物检验
食品安全国家标准
GB/T 4789.11
GB/T 4789.12
GB/T 4789.13
GB/T 4789.14
GB4789.30
GB4789.35
沙门氏菌检验
致泻大肠埃希氏菌检验
副溶血性弧菌检验
小肠结肠炎耶尔森氏菌检验
空肠弯曲菌检验
验金黄色葡萄球菌检验
食品卫生微生物检验
食品卫生微生物检验
食品卫生微生物检验
食品卫生微生物检验
食品卫生微生物检验
食品安全国家标准
溶血性链球菌检验
肉毒梭菌及肉毒毒素检验
产气英膜梭菌检验
蜡样芽孢杆菌检验
食品卫生微生物检验
拉单核细胞增生李斯特氏菌检验食品安全国家标准食品卫生微生物检验乳酸菌检验
GB/T4789.36
GB4789.40
食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌0157：H7/NM检验食品安全国家标准食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验5出口食品中弯曲杆菌检验方法
SN0175
SN/T0184.1进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法SN/T 0751
SN/T1022
SN/T1962
出口食品中嗜水气单胞菌检验方法出口食品中霍乱弧菌检验方法
食品中克雷伯氏菌检测方法
NMKLNo.156食品中致病性弧菌的检测和计数8
附录C
（资料性附录）
食品中致病菌DHPLC检测图谱示例C.1以沙门氏菌为例的DHPLC检测图谱沙门氏菌阳性吸收峰
DHPLC分析条件
4.04.55.05.56.0
SN/T2641—2010
洗脱峰
色谱柱：PS-DVB&CigDNASep色谱柱（4.6mmX50mm，粒度3μm）。柱温：50℃。
流动相：缓冲溶液A浓度为50.2%，缓冲溶液B浓度为49.8%。流速：0.9mL/min。
检测器：荧光检测器（光源：150WXenon灯：激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s）。
上样量：PCR产物5μL.。
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