【行业标准】 水稻及其产品中转基因成分实时荧光PCR检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2584--2010
水稻及其产品中转基因成分
实时荧光CR检测方法
Prolecol ofl real time polymerase chaix rtacon for deteeting genetically modifiec.coppnernts io rice sarall ita Hariweah proicts2010-05·27发布
中华人城
国家巅星峨验检魔局
教码陈
金品伴网ht
2010-12-01实施
本标准按照G「12G09给出的测元毕。SN/T2584-2010
本标准出国家认证认中监督管理委品会员中平月本标准起草单位中华人民共压原山人资价验检宠局中国扮验检疫科学研究院中作人民工和国出京出人境检验检疫局，中华人民共和阅湖出出入境检验检疫局。本标准点要起草人陈红道、梁新尚、陈效雅。正振华季冷、黄文排、湖小钟、宋水发、陈洪俊http://foodmate.net1滋園
水稻凝其产品理专基医成分
实附英光眼检测方达
S>/T2534-2010
本标准规定了水箱及来制品户转素内成分的冷测法。本标准运而子转B满心出水船（：1：点稻，工优卡6号）和时除草剂转基因水箱(LLRICH62，LLRICF601)的检测也适用】来制品P转因成分的检测。2规范性引用效件
下列义件对本文件的应别是必可少的，从是注川期的引用文件，仪注日期的版本适用下本文件，凡是不注6期的引用文件，其缺新版本（仙据所有的修收单)透用于本文件。0982分析实验空用水期格和实验方/11193书因检验实验究技术变求3V/11$4植物及H产品转基因成分检测抽样和制样方法3缩语
下列结略讲造而于卒文件
CrylA游购
编码苏云金穿胞杆菌(Bacillushurinugenxs）（:ylA：杀虫品体蛋当的基因。3.2
cryiA基图cryhAh yene
编码苏云金芽跑邦菌（Beiashuringinss）CrAh杀虫品体的草因。3.
ryhAb/erykA融台基菌ryAb/erylae usin gne\rylA基内与erylA。基因经人工拼按非放的渐图。3. 2.
lsaerb: phnsphate synthare
熊新磷酸合酶蒸因本标市作水泽内标滩某阀，3.5
9基因g
二个根部表达的水释英因，在在标准中用作水内标雄基因。3.6
Fl 基国poslipa ge
磷脂菌［鼎因
Ct 值ryele tireshoiei
您个发成管内的荧光信号创法设定的阅值中所经厅的循环数，某些品牌的量C限仪秘为CP(esspoin）值
ht
SN/T 2584--2010
4源理
应用T心Man探针技术限据带！的筛进儿因（启动+：终了等）序列.构建特异性序列（启动了博整山产与门标基因之问的序究力转花体特评监列和水粤内测基因序划，设计引物和装光探针，对让祥中基因组DNA逊行PC次扩增，在PCR技型积叶，我光信均的累积与ICR产物形成完会间变，因此可根据炭光信号的档度判定栏品！否合在特定的基内，5仪器和试剂
5. 1 主累位器
定量CR仪；冷冻研磨仪：消率次案销，息冰机：核酸蛋白分析仪：高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机：低湿冰符：旋振落带：政量够泌5.2主要试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯成生代点剂实整水应符合（B6682中级水的规格。主要试剂见附录人，水解内源墓岗和脸测匝外源黏因的开物和探计序刻表1。离！引物和探针列
测苯围
taMV3ES
与动/探饼底划--3
上海引物：rrgcgigaarge:1
下游引物ggte
探针：ggg1gg
游可物:1ageeicegteeg
下物tegagrcacazgigeicin
rggcngigiggi:gstt：ulek8
:ggggg.egt
：gntgesagle
茶：ig1ig1ge:rgtcuang18cet8
上游移-lceg
F物：anRzegkgliRcglc.c
探 giccH(eargngacale
游引物：ateg:tranacar:ggc?
梁:cntcgcaagaccggceES
主游物g2ena.igcgle.ear.ieas
一游物：LL:1a1
：icargranggt.1ghnR
l：游：gacceteceagttrgxaag
下新引物：artcieggtagugagaca深针：gacaaa
httn:
终浓度！
(-mci/l)
水霜密源基因
任选共
处出水福及采制品中精基因成
分帝选检颁
步山水技来制品中班基岗
(crylAh,cylAecylAi/clylAe)
筛选检测。
任选，
符酬速达
rryiAb/eylA-
Hankg gcuornic
scqur:nce
LI.RICF62
L.RICTh.1
6抽样与制样
，拙样
引物潮探密浮列（续）bZxz.net
可物/探净(5*)
J.游引物：katigciggng1gart
下游物gstarcghelat
tezagt.cu.ingiar.tgcacacapaa上物egggaatc2g8g
下引物：gigtceagnaggaehagghna探计：ateteucagr:crrgzeg
格物 dguiggegtategepeayrpn
下游小核：18rtancgsg-gag:cs
报cactatttr.at
I.游Hi:tci-ggateegaagrenatrg海频：5gagggcgcgagi1
探针：
ccnnraaaac
按照SNT1194的现定执行
6.2制样
终花度！
称取约200多样品：用粉整机或冷冻研磨仪将样品称碎继粉妆，7检测
7.1防污染措施
检测过释中防污染措施按照SN/T1193剂规充热行7.？HNA 提取
7.2. 1NA模板制备
SN/T 2584--2010
转本内水箱TT51-1(HI63>构建特异性输源。欧器官方指定的检测方然
转基因水档TT:1-（BIR3)转化本异兴检颁
许剂转因求积\1.1RT\E62
转化位特异性检测
耐除车剂转其闪水招\E:.RICESUI\转化体纤性检测
每个样品提取2个行管。称敢2001xg特痒的样品，加人1m预冷垒4的拆提液，剧摇动混匀店，在冰上静置5min.1条件下12000g离心15miu.弃上清液：加人600T预热到65的袋解液，充分置芯沉淀，在6C恒温保持1CmirH间题侧混列5次：空温条件下，10000g离心10min双上消液转室分.新离心管中，加人5u.尺45：A：37C恒温保持30min分别用等体积本；异应婷济液和三愈申烷：异成游溶液各拥摄次，维温然件下，行00高心招，取上清液转军男，新离心曾中加人三分岁休积异丙尊，分之体积01/1.酸钠液（15.6），一20效雪2h3h；在4C条作下，10000g离心Emim；1清液，用7c线乙洗涤沉滤-次，山乙醇，晾1流淀，加2
http:
SX/1 2584.-2G10
50 LTE(II8.C)溶解沉淀，所得溶液司为栏DNA溶毅法，也可使用效的人提吸试剂命。7.2.2DNA浓度测定
采用紫外分光光度法司烂TNA浓度·所测得（JT)作为该酸总散，紫外分光光度法检测核酸浓度的股信范国是2站/nL5u/ml.佰应该行！31的区间内将A济液微适当的释释，放人紫多分米州度计的比色而中，」260日M处测定H吸收择1-508/m1双链DVA减38/T单A，PCR级DNA溶液的./O8比-.7---2. 0.
1. 3RC反应
7.3.1阴性对照.阳性对照和空自对照的设置以非转基[水裕为阴性对点.以转基因水陷为阳性对照，以水或TE溶液为窄白对照。7. 3. 2P联反应体系
FCR反应体系见表2。链个DVA样品做2个平行管，加时应使样品DNA落液究全加人反应液巾，不要粘附子噻！加样后应尽愤盖紧管盖表 2PCR反应体系
试剂名称
TagMan tEniversal Master Mix(? :中欲(上游）
亚（下游）
DNA模版（20g-30rg/.
补水至
7.3.3仪器设置
终浓度
0.2 μmol/l.--0, 8 μmot/1
0. 2 amal/1....0, 8 nsl/1.
3, 1 μma./1.-~(. 4 umol/L
设足样品名称、报当基因和巡炎基闭的种类、光偿导败集等，7.3.4CR反应参数
实时炭光PC求护增反成参数贴表3实时类光限反应激
UNG海消除我阳污热
语化DNA合变媒/预变性
PCRA个循
滨火/慈神/英光信号收共
http:
福度/%
7. 3. 5照反应运行
SN/T 2584—2010
核预先设定的样品类放顺将1CE发成管依次举效！上机前产意给查各反应管是否盖紧，以免炎光物质泄漏污染仪器），开始运行仪需逃行实时凝光PC反应。3结器分析
8.1阅值设定
实时获光PCR授成结束盾。设督家光信阅估，测信设宽原则报所仪券柴声情况逊行谢整；以阅值线刚好超过正常附能栏需扩磨而继的般高点为液8. 2 质量控制
率广对：内源基因和外源苯因均无丧兴增幅象，所性对照：内源基因有荧光管帕现象三（位小丁豌等于36外源因心炎光增福现象。阳性对照：内源基国动外源基对均有费光增是现象，IICt值小十成等于S，［述指标有一顺不格个名脱明R友品体系还常，度重新选行实时以R增9结果判定与表述
9.1结果判定
测试样品外源基因检测（t值等，判该样品不含所检的外源基因，测试样品外源基检测C值小下或等“35，判断该样品含有所检的外源基岗。测试样品外源基因检测C1估在36之间.应调整模板浓变，重做实时荧光PCR，内次扩增店的外源因检测（直仍小下4则可判定该祥品检比义其因，再次扩增层的夕源常风检测估等下，则可测定为该样品未捡出义文》基因，9.2结果轰述
该样检出义基因品系）
该群检出义义：国（点索）
品伙伴网ht：
Sx/T 2584—-2010
度：110 mol/1.氢氧北钠(sH)熔微录A
范连附徽！
孵试刻
在10 mL水十人80氧化钢泽解后加水定容至20CmI，塑料瓶中保存。A.2 C. 5 ml/L EDTA 溶液(pI8.0)除胶水乙二钱四Z酸二纳Na。H$,6人 m水加人是13 mol/氮氧化钠溶液：加热室宗全溶解盾，冷却至空温：用0批s1/.氢气化纳游液调pII至8.0，川水定容至1c0 ul.在103. 4 kla(1 )系外下国 irA. 31 inol/ Tris-IICl 溶液(H8. 3)称取,1. =羟甲表氨ri!溶解 S ml.水剂浓盐酸凋1牟 8.0,加水亲容令1 l 在 103.4 kPa(121 )条件 肉 r,A, 41 mol/. :is.11Cl(rjr7. 5)称最121.1Tris碱溶解十800 L水中,活浓腔调pH 至7.,用水容至「J。在103.4 kPa(121 )条件下次菌20 nin
A.510 me/ml.RVeseA
将糖RNA随(RVas A;溶T 1 :ra:l/1.Tris.1!l(p)7.3),15 mmol/1.氯化钠中，期成 10 mg/ml.的涨度，下100℃加热15min.缓慢冷却个宰湿.分装或小份依存十一89 ℃。A.6 3 mol/L Z酸(pH5, 6)
称取4c8.3g三水乙腔钠溶解乎303l.水中.1-2z.酸调pH至5.6,用水定容至11。在103.1kPa(121)条件下灭菌20
A.7抽提液
在60m.水中入.g架糖.2g桑7吨咯烧原（K30）（PVP），1g一Z胺基硫代中酸销（SodiumdicthyldithiocarborsteDIECA.分滚牌，然片ln人1mol/l.Tris-HCl(pH%.5）ooml0.5m0l/L EDTA(II8.0)12 mL小宝穿率！保存,使用时加人0.2%（体积分数)的巯基Z
8裂解波
在60GmL水中加人8-,78熟化钢.20 十六烷是中基这化铵（TAJ3),2C共聚艺烯吡略烷酮(K30)PVP)，：g二胺均硫代甲酸纳<&ndi.mlic:hyidthiecarbomate.DIECA)，充分溶解，然后加人 1 mol/I Tris HClμH?. 5)10) L..0, m/L. FTyA(pH8,C)4 ml.,删水定容至 1 L,案潮保存.使用时灿人0.2%（休积分数)的3巯基了够A,T绥冲液(p11B,0)
分别人 1 nol/I. Tris HCpH8.9:10 ml : , mut:L EA(pl18.0)溶液2 l,,水定容至1C ml准 103,1 kPa(]21条准下灭菌2 ninA0紫酚：三氯甲烷：这溶液
将举附、兰氯甲烷利导醇按照25，21：1的体积比浪合。A.三愈甲烷：异段溶液
将三氯中烯和异必醇接按照2：1的体积比退个A.12异内醇
A.13705乙醇（体积分数）。
htti
SN/T2584-2010
http:
中华人民共和国旧人境检验论疫行业标滩
水韬及其产品中转基因成分
实时荧光PCR检测方法
SN/T 2581 -2010
中同标证出版社出版
北京复兴门外－里河北街18号
邮编码：100915
网址spc.el.cr
话：385939468517348
中国核准出版社索皇岛印刷）印剧*
丁本 #81X 1230 1/:6
即张0.75
学数13干学
2010年13月第一版
2010年0月第-次比刷
印数！
F0：155086.2-31189
Foomnt
定价16.00
0107892
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。