【行业标准】 产黄曲霉毒素真菌PCR检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/12582-2010
产黄曲霉毒素真茵CR检测方法
Detection of aflalukigenic sirains ef As pergiilus by PCR2010-05-27发布
中佳北和国
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金品伴网ht
2010-12·01实施
本标准按29给品的源则
SN/T 2582--2010
本标源山国家认证认可监督管理委员会医出H。本标准起卓单位：中华人民共和国浙江山人境途验检安局、浙江省疾病预防控制中心、浙江大学。本标准主婴起萨人：举消、王志刚.应盛华、张晓峰力蓉、可.何水强、藍蝇、帅汇兵、顺主慧俊离。
http://foodmate.net园
产黄的需毒家享菌P服检测方法
S/T 2582--2010
本标准观定工食品、粮食和饲察中产费而尚穿察的黄曲微和市生香的PR检测方法。本标准适可食尚、粮食利饲料黄斯漂高索的尚前需和寄生需的检测2规范性引用文件
下列文件对于本文件的成用品必不叫的，用是注思的引用义件，仪注说的版本适本文件风是不注H期的引用文件。片新版不（低性所有船修数单)适用于木文件。（19489实验室，准物安全过川要求G13/1478：，15食站卫生微生物学检验蒙肉游母蒲数CB/T179.1食品生微生物学检验常克产幸靠案的鉴众分所实验空！门水规格和试歌宏法G/T 6682
103口食品中土要产崔商检验方法萨床诊断中聚合陈链式反应CR)技术的应川WT 230
3窥语
下列缩洛消适川代交。
efR aflacoxn siorynthesis rigulatory gene产黄震索调节因。
DEr diethypyocsrhanale
痘炭酸乙归。
dNrdeoxyriooneeus: ziphesphrt癌氧核白酸一磷酸，
Irsinterrel t-anscriberi pacer为部转求间隔区
aierignatocyainomu.yl:rns.craneweteom-1
柄荐素转甲氨东醒基因。
P'R polymcrase chain resulia聚合酶式反成。
httn
SN/W2582--2010
vr--I versierlurin A dehydroge:ar gel.:杂山藓素A脱氢萨基因，
4.生物家全措施
为了保护实验案人员的安全，应白具备资各书「人员险测效病偿，所有培养物应小心处置。应按照（048的有关规定执行：
5废弃物然理和防止污染的措施
5。1检测过程中的废弃物需经12」高所灭理30mi店内置5.2检测过程中防止交义污染的指施见W3T23中污染的陷和控制规定。6原理
口前已知产黄由舞索真菊主域内霖划生曲需，本方法选用黄也霉越素生化介成过程中的个美键梦因：调控基因aLR，树步标素转用氧随5m:1剂杀色出碍素A脱氧酸ver-1的有来判断得检菌株是含能够产生黄的莓变素，按照黄谢需光索生化成过在，只要缺少1述个关键基因之均不能合成英出需声素。另外使用点颜其有.8SrDNA的ITS列作为机参标可判断提取的DNA模板和PCR反应光否合适
7试剂和材料
除特殊注朗外，木法所用式剂均为分析纯或4化试剂：水为（H/6682规定的一级水。7.1紫医培养液:见附录 A第 A.1 章。7.2DNA提收溶液：见除录A第A.2节7.3引物：光衣1
表引物序劑
产物名踪
引物名称
Vi-F VerR
“游物率到
3+ TCGGTAGGPGAAUGTGCGO-3
5-TCCTCCGCT.A.TGATATGH:3
5' TGAAAGITGGGGGATAGG GTAGG 3G CGIGAGACAGAGACTGGACALXGS*
:GIGGACGGACCTAGTTCGAG4 CAC-3F-GTCGGGGCAEGCACTGGGTTGGG3
FGCGGGAGGCCGCGAAAAGIGGT-3
S:-CGGCAG-CAATTRCTAEGRAGCG-
7,4dNIP,dATP.dTTP,dCTPGTP
http:
物度/p
产物长度/hp
7.510×PCR级冲液.
7.6Tag NA聚分酶
7.7境脂赫：电涂纯
7.#澳优之错。
.9分平最核记1cobpJaearDNAMaera7. 10
电泳缓冲液沈附求A第八3章
川样缓冲液：死附录A第A.4市。2 me/氯化镁
耐策用统及限混合液（体积比2：1）三氟甲烧异戊醇误合液（休积比24：1)：酸钠
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7.1810 /m的RNA酶，
7.19DEPC水：在1O0mL去离了水中人10）LC.弥置过夜后高压灭调。7.20性质统菌株：用产点出微素离标（如黄用蒙标雅商模Aes23.1408：或者宽4用Apergitiuparasir3447.或H合俗称），图性质控：用不产莫山街索真菌（如烟宽Apegittsfmga3o，成送盒格株）#主漫仪器和设备
8,PCR 仪
2齿逆台武冷该离心机，不小了1C000品：B.3天平带01
8.4冰籍.420℃
8.5摔床：25℃+2，可请速
8.5均成器
微调移液错菌吸头25，102ocoL,2ul！nB.7
我菌PR反成管2.nmLC.2m.
B.9电泳议、
紫外线观测仪或凝胶成像分析影统8.101
高上天菊。
制冰机。
试管:12 mmx1c0 mm,
9检测程序
样品制餐
会照GH/T4789。15进行
产的舞素意的培家
参照SN/T1035和C13/T4789.16进行3
http：
foormnt
N/2582--2010
9.3PCK检测
9.3.1可凝产黄幽需毒素真菌的丝培养在无菌条件下片均烧过的接销不挑求六川爆产质出再真菌的您接种到装有：拉萨民增养游的试管中在.80频人美
S3.2产黄曲需毒素真菌nA的提最实菌所体用整氮预冷，从液体境美市排最案丝約到御中，加液氮研磨菌丝至粉不状。加人50A烧收没人而然评地德粉木状菌丝成是河液·菌丝总浮液吸人火菌的2.m.无PCR管中，加5ml.RNA效（.0mg/ml..87C水浴joir后：加约等体积的研氯中烧-异成醇混合波（体积北25：2：1)后，剧烈摄荡toin4:下3c0g肉心ICmi:1：收集1清液转移刻新光菊PC管中，训等体积的三氯中烷-异皮源混合液（体积比剂：1）混分行卫同样肉心10i。！滑液转移望款的2.0m1的无商PCR管中，添用10%体积z酸钠a5优积无求之醇，颜倒温片置了20%保器1h然片要下9300%离心10mi收集沉淀，川75%乙我600叫l洗涤后拆条件下再次离心in：空澡证淀xi，最多o.水解的DNA样品置于-下限存符用
9.3.3CR检测
B.3.3.1CR增体系（分别控增er.1，mt-1R利[的日的基因或序列片段，见表2装2PF反应体系
尚R缓流：含化镁）
化镁游液2.Gul/I）
P落液各2.mo1/L
TINA聚合嗨：GU/）
[游物(20 0:1)
下（2tl/）
NA极(10 /.
补水垒
在反底怀系山的术刺数
0 μ--
933.2C增条种4变性2m91气安30C退火30和72C延0其35个循环：最后72延伸7min.
9.3.4凝胶电泳检测产物
用65人T13电棕缓冲液制名：1，的琼悟糖新践（凝胶融化后冷却室60在石加人合量为0.g/ml.的溪化之谁或者在源店用0.m演化之键溶液进行资色），将8证PCR物与2加样缓冲液，分划人到对的舒十，在孔期人活量的分了量标记物，选释个适的电儿进行出泳（股腔制在5心V法时阅3）mit最用凝股成像系统进行划察分析年记。bzxz.net
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9.3.5反应体累对照的设置
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9.3.5.1进行PR检测度应然率前股置性划股即半对照牢对赔9.3.5.2乱性对照：前性源裤菌株A63.145求者资生曲需A33.140了我他介格菊株据取的DNA作为模板
9.3.5,3别性对照：用烟得AS3.3772或其德合格慌赖德取的1)NA作为模板9.3.5.4穿对照：月配紫反应休的实验案润代势NA模被8结果分析与判定
结果判定
10.1样品PR扩增产物中球片，出现600充T基阅片段其他个国片段（ROm和-1只要个一个不出现同的说生对照增产物电添活日的片为979F有R基因片段）600bp充（1Ts基风片段）?在有（0m：基钢片段）和452充名（er-1因双）均团性对照只出现有石英因片段到牢对照扩增产物电滤没有山源门的片段：判定结果为限临
10.1.2样品的PCR我增产物出陪·979p来（R匹片股600左行门TS熊内升）797左（0m=二款因只技和452bp在名-1集因片段）的增条带购出现，时时沿泽对热增产物电泳后门的片段97hr无名（afR杰因片段），cohp左有（ITS基因片段）707bp左（ol-本因片段和2左右（er-1因片段）均现计激山现00左（感因空自对照软增产物也泳活没有出现国的片段划定绍乐为可凝阳性，10.1.3对于判建结果为可凝阳性样品：成进产送纯化培靠片，接低5V/11035和（13/工1739.16进行黄曲需靠索测宽，进行进·确认，始确认结果为阳性，判定结果阳性；如确认结果为别性，划定绪到性
10.2结果表述
如判定统果为相性，结集表述为“检出产黄前等声索的菌曲霖或简生用需”：如判定结果为创作，则结果述为“未检产黄山宽毒素的故典霉利街生鼠鑫”http
SN/2582.2010
A.1萨[C单养滋(SIDB)
A.1.1鼓分
病酪蛋白陈(或蛋一陈)
薛以粉
蒸馏水
总1.2制法
陈鼠A
（炳深性附录）
培养基和试剂
t uc oul.
将上速各皮分加熟点沸落解，冷去：酒16、0--心、2，分装.121℃火菌5min备用。A2DNA提取缓液
0.2 M ris-Cpl7 ),i.5n 家tC mmoEDTA，(所浓sDs我.3t泳缓液：[r1:4g调胶25g..：mA（118.C)20m蒸馏水至1000ml便别时10倍群。
A4加样缓冲液：0.烫盐，0.蓝F，265满302nol/DT。.//uwwfoodmate.net
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SN/T 2582-2010
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中华人民共和国出人境检鉴检疫行业标
产黄曲霉毒素真菌PC检测方法
SN/T 2582.- 2011)
心国标准高液社出版
北京复兴门外：#河北街与
邮政缩码:1:n01
网止 www, sne, nel. n
电话：65233466817518
中国标雅山版社索鼎岛印刷：家别本：580×_230-/16印张0.75李数[2下字201C年10月第一版2010年10月第－次印输印效1600
书4：153866·2-2.187

定价16.00元
0102--2892 1/NS
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