【商检行业标准(SN)】 贝类包拉米虫病检疫技术规范

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2434—2010
贝类包拉米虫病检疫技术规范
Protocol of quarantine for Bonamiosis in shellfish2010-01-10发布
中华人民共和国
数码防伪
国家质量监督检验检疫总局
2010-07-16实施
SN/T2434-2010
本标准非等效采用了国际动物卫生组织（OIE)编写的水生动物疾病诊断手册（2006版）中2.2.1INFECTIONWITHBONAMIAOSTREAE和2.2.1INFECTIONWITHBONAMIAEXITIOSA等有关章节。
本标准的附录A和附录B为规范性附录，附录C和附录D为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准主要起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准参加起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国黄岛出入境检验检疫局。本标准主要起草人：吴绍强、林祥梅、刘、岳志芹、刘建、郑腾、李西峰、韩雪清、贾广乐、梅琳、王彩霞。
本标准为首次发布的出入境检验检疫行业标准。1范围
贝类包拉米虫病检疫技术规范
SN/T2434—2010
本标准规定了包拉米虫病检疫时的样品采集、组织印迹、病理切片以及PCR检测时的操作规程。本标准适用于牡蛎等水生动物及其产品中携带牡蛎包拉米虫（Bonamiaostreae）、包拉米原虫(Bonamia sp)等包拉米虫的检疫，也可用于养殖场包拉米虫病的监测。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出人境动物检疫采样
SN/T1193基因分析检测实验室技术要求3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
包拉米虫病Bonamiasis,Bonamiosis由牡蛎包拉米虫（Bonamiaostreae）、包拉米原虫（Bonamiasp）等在宿主血细胞内寄生或者游离在结缔组织、鳃、内脏或套膜上皮中而引起的水生动物的一种严重的寄生虫病。3.2
SSUrDNA
小亚基核糖体DNA，为生物物种较为保守的DNA片段，常被作为物种分类及鉴定的依据。4概述
包拉米虫病是严重危害世界贝类养殖业的主要疾病，也是OIE规定的贝类必报疫病之一。病原为包拉米虫，现发现的包拉米虫包括五个种，除主要寄生在欧洲牡蛎体内的牡蛎包拉米虫（B.ostreae)外，还有寄生在悉尼牡蛎体内的B.roughleyi、欧洲牡蛎体内的B.ezitiosa、美国牡蛎体内的B.perspora、澳大利亚牡蛎体内的B.SP。天然宿主包括欧洲牡蛎、新西兰牡蛎、阿根廷牡蛎、葡萄牙牡蛎、中国鹑螺，不能感染太平洋巨蛎、美洲牡蛎、河蚌等贝类。感染后症状主要表现为闭合肌萎缩、退色成黄色，颗粒性白细胞增生，出现灰白色小溃病或穿孔性溃疡、血细胞破裂、血球渗出。性腺、套膜、鳃出现大范用损伤，并最终导致死亡。
5材料
除另有规定外，所用化学试剂均为分析纯。试验用水要求达到GB/T6682中一级水的要求。5.1涂有氨基烷基硅烷（aminoalkylsilane)粘附剂的载玻片、5.2姬姆萨染液、苏木精-伊红染色液、伊红染液、返蓝液、Davidson's固定液等，配制方法见附录A。5.3DNA抽提所需要的相关试剂或其他商品化组织DNA提取试剂盒，见附录B。5.4PCRbuffer、硫酸镁、dNTP(2.5mmol/L或10mmol/L）、DNA聚合酶、DNAMaker、电泳上样缓1
SN/T2434—2010
冲液等，均为商品化试剂盒中成分。5.5电泳缓冲液：配制方法见附录A。5.6二甲苯、封片树胶。
5.7无水乙醇。
5.8琼脂糖。
6设备
生物安全柜。
PCR仪。
电泳仪。
凝胶成像仪或紫外透射仪。
生物显微镜。
一80℃的超低温冰箱、一20℃普通冰箱、4℃冰箱。高速冷冻离心机。
组织研磨器。
高压灭菌锅。
水浴锅。
制冰机。
微量移液器及配套的吸头
检测方法
7.1采样
7.1.1采样点的选择
应根据实际情况，一个区域的一个种群至少选取3个采样点，大范围的几块不连续地区养殖易感品种，应增加采样点。
采样按照GB/T18088规方法进行。7.1.2采样技术要求
7.1.2.1有临床症状的牡蛎
至少挑选10条濒死的或可疑的个体。采样时牡蛎应当是活的，牡蛎应当在活体或杀死后分别包装放在密封冷藏的容器中送到实验室。所采集的样品应严格避免冰冻。在感染早期一般取牡蛎的心室，在感染中、后期主要采集牡蛎的鳃、结缔组织、套膜上皮、消化道、性腺及胃。7.1.2.2无临床症状的牡蛎
应采集达到统计学显著意义数量的牡蛎样品。当养殖场的个体有怀卵时，应每年在产卵期采集一次精液或卵液。如怀卵群体由不同年龄的牡蛎个体组成，应选取两岁龄的牡蛎采样。样品应包括该地所有的易感品种。
对无临床症状的牡蛎，取其心室、鳃、性腺等。7.1.2.3监测目的的采样
监测时间应选在一年中最能观察到临床症状并能检测到该虫的温度和季节。每次采样的牡蛎数量要以感染率等于或大于2%时检出的概率进行抽样。最常见的情况是应采集150个以上牡蛎。7.1.3样品保存及运送
采取的样品应在取样后24h内送人实验室，要附有标签，清楚标明采样地点、来源和养殖历史。7.2组织印迹法
7.2.1组织样品的选择
选取成年活牡蛎的鳃、卵囊、心室。2
7.2.2制片
SN/T2434—2010
将所取组织用吸纸吸去多余的水分后，用锻子将组织在载玻片上轻轻积压涂片，在载玻片上形成薄层膜，自然风干，丙酮或甲醇固定印迹，滴加姬姆萨（Giemsa）染液4滴～5滴，固定1min，然后按1：1~1：2的比例加缓冲液（pH6.4~6.8的磷酸盐缓冲液）用洗耳球吹匀.染色5min~10min，流水冲洗，晾干，置于1000×显微镜上观察。7.2.3结果判定
虫体呈球形或卵圆形，通常大小在2μm～5um。细胞质染成浅蓝色，细胞核染成红色。多寄生在血细胞内，感染严重时，血细胞外也有寄生(虫体形态特点参见附录C)。7.3病理切片技术
7.3.1组织样品的选取
活着或刚死的牡蛎组织鳃、套膜、性腺等。7.3.2样品前处理及制片
7.3.2.1样品的固定
用Davidson's固定液固定样品，固定液与组织块的体积比应为10：1，固定时问应在24h以上。7.3.2.2石蜡切片制备
具体操作流程及溶液配制见附录A。7.3.3结果判定
虫体呈球形或卵圆形，通常大小在2μm～5μm。细胞质染色嗜碱性，细胞核染色嗜伊红性，多寄生在血细胞内，感染严重时，血细胞外也有寄生。此方法不能检测到感染包拉米虫的潜伏期。虫体形态参见附录C。
7.4PCR检测方法
7.4.1材料
选取活着或刚死的牡蛎组织鳃、套膜性腺等7.4.2操作步骤
7.4.2.1DNA的提取
实验室操作按照SN/T1193的要求进行从采取的牡蛎样品中抽取25mg样品，剪碎后参见附录B中提取组织DNA的方法提取待检组织基因组DNA，也可采用商品化的组织基因组DNA/提取试剂盒进行。除检测样品外，需要设立如下对照：
取已知感染包拉米虫的牡蛎组织作为阳性对照；取未患病的牡蛎个体组织作为阴性对照。7.4.2.2引物
针对包拉米虫SSUrDNA基因设计，具体序列为：BO:5'-CATTTAATTGGTCGGGCCGC3\BOAS;5-GGGGGATCGAAGACGATCAG3*预期扩增片段长度为300bp，引物合成后采用灭菌ddH.O均稀释为10μmol/L。包拉米虫PCR目标扩增序列参见附录D。7.4.2.3反应体系
在PCR管内，加入10XPCRBuffer2.5μL，5U/μLTagDNA聚合酶0.5μL，10μmol/L上下游引物各0.5μL，10mmol/LdNTPs2μL，模板DNA2μL，补充ddH.O至25μL。7.4.2.4扩增程序
94℃预变性5min；之后94℃变性1min，58℃退火1min，72C延伸1min，共35个循环；最后72℃补充延伸10min。
SN/T2434—2010
7.4.2.5琼脂糖电泳
取5uL样品PCR扩增产物，进行1%～2%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，用凝胶成像仪或者紫外透射仪观察结果。
7.4.3结果判定
7.4.3.1试验成立的条件
只有阳性对照有300bp的扩增条带，同时阴性对照没有相应片段的PCR产物时，才可判定本次试验成立，否则本次试验无效，需分析并排除引起试验无效的因素，并重新试验。7.4.3.2样品检测结果
在阳性、阴性对照都成立的前提下，若检测样品有300bp的条带，则判定样品包拉米虫PCR检测结果阳性，若检测样品无300bp的条带，则判定样品包拉米虫PCR检测结果阴性。8结果综合判定
8.1可疑判定
特定宿主动物组织通过病理组织切片、组织印迹、PCR检测，只要某一项结果为阳性，则判为可疑。8.2确诊判定
对于可疑病例，需进行PCR结合PCR产物测序作出确诊。A.1姬姆萨染液的配制
附录A
（规范性附录）
组织印迹、病理切片相关溶液配制SN/T2434—2010
A.1.1贮存液：称取姬姆萨粉0.5g，甘油25mL，甲醇25mL。先将姬姆萨粉研细，再逐滴加入甘油，继续研磨，最后加入中醇，在56℃放置24h或者室温放置3d～5d后即可使用。A.1.2工作液：取贮存液采用蒸馏水50倍稀释即可，临用时配制。A.2石蜡切片制备
取材固定24h→修整组织块，换固定液→重新固定12h-→自来水冲洗24h-→70%乙醇1h-→+85%乙醇1h-→95%乙醇45min-95%乙醇45min-→无水乙醇30min-→无水乙醇30min→无水乙醇二甲苯30min-→二甲苯5min~20min-→二甲苯5min~20min-→石蜡1h~1.5h-→石蜡1h~1.5h→+包埋→切片→贴片→烤片→二甲苯10min→二甲苯10min-→无水乙醇2min-→+无水乙醇2min→95%乙醇2min-→85%乙醇2min=→70%乙醇2min→蒸馅水3min-苏木素染色5min~20min-→自来水洗3min-+1%盐酸乙醇8s~15s→自来水洗3min-→返蓝液2min~5min-→自来水5min-→蒸馏水5min→85%乙醇2min→+85%乙醇2min-0.5%伊红染液1min~2min-+95%乙醇2min→95%乙醇2min-→+无水乙醇2min-→+无水乙醇2min→二甲苯2min→二甲苯2min→封片。A.3Harri\s苏木精染液的配制方法苏木精
无水乙醇
硫酸铝钾
蒸馏水
氧化汞
冰醋酸
分别用无水乙醇溶解苏木精，蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，然后两液混合并煮沸，加人氧化汞，继续加热和搅拌至溶液为深紫色，立即用冰水冷却，恢复至室温后过滤备用。A.4伊红染液的配制
配方为：
水溶性伊红
70%~75%乙醇
伊红用蒸馏水（少许）调成浆糊状，再加人乙醇，边加边搅拌，直到彻底溶解，此时试剂有些混浊，取少许冰醋酸，加入到试剂中去，试剂逐渐转变为清亮，呈鲜红色，染出切片，效果很好。A.5Davidson's固定液
95%乙醇
38%甲醛
1200mL
1200mL
SN/T 2434—2010
冰醋酸
返蓝液的配制
10%(临用前加)
取5mL氢氧化氨，加人1000mL蒸馏水中即可，A.7
电泳缓冲液的配制
50倍TAE电泳浓缩缓冲液配制方法为：取Tris碱242g、冰醋酸57.1mL、0.5mol/LEDTA10mL，用5mol/L的盐酸调制pH8.0，定容至1000mL。用前采用蒸馏水50倍稀释即可。6
附录B
（规范性附录）
样品DNA的抽提
SN/T2434—2010
B.1将新鲜牡蛎的消化腺上皮、腮、触须等组织25mg置于冰冷的生理盐水中反复冲洗，滤纸吸干表面水分后称量（根据需要），置于匀浆研磨器中并加入冷的生理盐水，进行手工匀浆研磨。注意整个过程在冰上完成。
B.2将B.1匀浆液倒入2mL塑料离心管中，加20μL蛋白醇K，再加SDS至终浓度为1%，上下颠倒混匀。
B.3混合液置于55℃水浴，水裕2.5h。B.4向匀浆液中按1：1比例加入酚/三氯甲烷/异戊醇混合液（25：24：1），轻轻振荡混匀5min，12000g离心5min。
B.5吸上层水相800μL于一灭菌塑料离心管中，加入等体积酚/三氯甲烷/异戊醇混合液，轻轻振菌混匀5min，12000g离心5min。
B.6吸上层水相500μL于一塑料离心管中，加人两倍体积的无水乙醇，一20℃放置2h或液氮中放置5min.
12000g离心5min，沉淀bNA，倾去上清液。B.7
于沉淀中加人75%乙醇溶液500L，轻轻混匀后12000g离心5min，倾去上清液，室温晾干。B.8
向DNA沉淀中加TE缓冲液-100-μL-溶解，20-C保存备用。B.10
或者采用等效的DNA提取试剂盒，按照说明书进行操作SN/T2434—2010
牡蛎消化腺组织中的虫体
（资料性附录）
包拉米虫形态
图C.2牡蛎组织连接处血细胞内寄生的虫体牡蛎组织细胞内的包拉米虫（HE染色）图c.4
牡蛎血液中的包拉米虫(HE染色）附录D
资料性附录）免费标准bzxz.net
包拉米虫PCR目标扩增序列
SN/T2434—2010
cattiaall ggtcgggccg ctggtcctga tccttactt tgagaaaatt aaagtgctca aagcaggctc gcgcctgaat gcattagcatggaataataa gacacgactt cggcgccgcc tcggcggttg ttttgttggt tttgagctgg agtaatgatt gatagaaaca attgggggtgctagtatcgc cgggccagag gtaaaattct ttaattccgg tgagactaac ttatgcgaaa gcattcacca agcgtgttt ctttaatcaa gaac-taaagt tgggggateg aagacgateag黑体、下划线部分为引物序列。
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