【SN商检标准】 国境口岸鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4276—2015
国境口岸鼠疫耶尔森菌荧光
PCR检测方法
Detection of Yersinia pestis in rodents by real-timePCRmethodatfrontierport
2015-05-26发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-01-01实施
本标准按照GB/T1.1-一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4276—2015
本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、北京市海淀区疾病预防控制中心、中华人民共和国福建出人境检验检疫局。本标准主要起草人：田洁、陆琳、郭惠琳、何斌、刘艳华、任彤、赵静、黄恩炯。I
1范围
国境口岸鼠疫耶尔森菌荧光
PCR检测方法
SN/T4276—2015
本标准规定了国境口岸鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测方法的检测对象，标本的采集、处理、检测程序。
本标准适用于国境口岸鼠疫耶尔森菌的荧光PCR检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T28940病媒生物感染病原体采样规程鼠类GB/T28942
病媒生物感染病原体采样规程蚤SN/T1240国
国境口岸鼠类监测规程
SN/T1292
2国境口岸蚤类监测规程
WS279鼠疫诊断标准
人间传染的病原微生物名录（卫生部）3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
鼠疫耶尔森菌Yersiniapestis
俗称鼠疫杆菌，为革兰阴性短粗杆菌，菌体两端钝圆且浓染，亦易被苯胺染料着色，大小为(0.5um～1.0μm）×（1.0um～2.0μm）。一般分散存在，偶尔成双或呈短链排列，无鞭毛，不形成芽胞。鼠疫耶尔森菌是鼠疫的病原菌，鼠疫是一种人兽共患的自然疫源性烈性传染病，人类鼠疫多为疫鼠的跳蚤叮咬而感染，是我国法定的甲类传染病。鼠疫传染性强，病死率高，易酿成大流行。鼠疫耶尔森菌主要累及皮肤和淋巴结，其次为败血症、肺炎、脑膜炎。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）Ct值：循环值，每个反应管的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数（cyclethreshold）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）PBS缓冲液
SN/T4276—2015
含0.5%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液生理盐水
0.9%的氯化钠水溶液。
实验室生物安全要求
按照《人间传染的病原微生物名录》规定，本方法中鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测应在GB19489规定的生物安全Ⅱ级（BSL-2)实验室内进行。6
检测对象
国境口岸疑似鼠疫耶尔森菌感染者的临床样品国境口岸可能携带鼠疫耶尔森菌的医学媒介生物样品。国境口岸疑似鼠疫耶尔森菌污染的环境样晶主要仪器设备
本方法使用的主要仪器如下
实时荧光PCR仪；
二级生物安全柜；
高压灭菌器；
70℃超低温冰箱（或液氨罐）
普通冰箱；
高速台式冷冻离心机（最高转速13800g以上微量可调移液器（10L、200μL、1000μL)及配套的一次性带滤芯吸头；
水浴锅；
组织研磨器。
8试剂
本方法使用的主要试剂如下：wwW.bzxz.Net
无菌生理盐水或三蒸水；
PremixExTaqTM(ProbeqPCR)\);引物；
阳性对照；
阴性对照；
探针。
1）给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示只认可该产品。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用等效产品。
9检测程序
9.1样本采集
SN/T4276-2015
鼠类样品的采集、运输和保存按照GB/T28940、SN/T1240操作；蚤类样品的采集按照9.1.1
GB/T28942、SN/T1292操作。
9.1.2临床样品的采集按照WS279操作。9.1.3环境样品按无菌技术操作，取适量置于无菌容器中密封保存。9.1.4在采集过程中做好个人防护。9.2样品检测
核酸提取
9.2.1.1煮沸法提取核酸
以无菌方法称取0.2g粉碎的固体环境样品，加人1mL的无菌去离子水，充分振荡9.2.1.1.1
2000r/min离心4min，收集上清液，将上清液8000r/min，离心5min，收集沉淀；沉淀中加人0.1mL无菌去离子水，沸水中加热5min；8000r/min离心3min，上清液作为PCR扩增的模板。9.2.1.1.2以无菌方法吸取液体环境样品（如：水、饮料等）3mL，12000r/min离心2min，去上清液，收集沉淀；加入0.1mL无菌去离子水，沸水中加热5min；8000r/min离心3min，上清液作为PCR扩增的模板。
9.2.1.1.3以无菌方法将0.1mL血液或体液样品置微型离心管中，沸水中加热5min；8000r/min离心3min，上清液作为PCR扩增的模板。9.2.1.1.4以无菌方法取人类或鼠类组织样品0.025g，用0.1mL无菌生理盐水或三蒸水研磨；将经过鉴定的适量的蚤加0.1mL无菌生理盐水或三蒸水研磨，将制得的组织匀浆液转移至离心管中，沸水中加热5min;8000r/min离心3min，上清液作为PCR扩增的模板。9.2.1.2商品化DNA提取试剂盒提取核酸用商品的DNA提取试剂盒处理标本，具体操作参见该试剂盒说明书。9.2.2荧光PCR
9.2.2.1引物和目的基因
本方法使用的引物探针如下：
—上游引物Cafl-F：5'-AGGTAAACGGTGAGAACCTTGTG-3'，位置为365bp-387bp；下游引物Cafl-R：5'-CAATTGAGCGAACAAAGAAATCC-3'，位置为420bp-442bp；—探针Cafl-T：Fam-ATGACGTCGTCTTGGCTACGGGCA-Tamra，位置为392bp-415bp。9.2.2.2反应体系
反应体系设置为20μL，组成见表1：SN/T4276--2015
PCR反应液
9.2.2.3扩增程序
表1Taqman实时荧光PCR反应体系组
Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2×)PCR Forward Primer(10 μmol/L)PCRReverse Primer(10 μmol/L)TaqManProbe
DNA模板
反应体系为20.0uL，不足的用灭菌蒸馏水补齐使用量
将加好样的PCR反应管分别转移到荧光PCR检测仪上进行扩增反应。程序设置为以ABI7300全自动荧光定量PCR仪为例说明，将荧光信号设置为：ReporterDye：FAM，QuencherDye：TAMRA，选择ROX荧光信号校正。扩增程序为94℃×5min；95℃×5s，60℃X30s，循环40次。由于不同的荧光定量PCR仪性能有差异，应按照实际机型进行反应程序设置，没有ROX荧光通道的荧光定量PCR仪，不进行ROX的设置。
9.2.2.4基线和对照
根据使用不同的荧光定量PCR仪设定好基线，设定的一般原则以阈值线刚好超过正常阴性对照折增曲线的最高点，也可根据仪器噪音情况调整。阳性对照为鼠疫耶尔森菌基因组DNA或含鼠疫耶尔森菌目的基因的质粒；阴性对照为不含鼠疫耶尔森菌的样品。
9.3结果判定
9.3.1质量控制
反应结果应同时符合以下2个条件：阴性对照无扩增曲线；阳性对照Ct值≤35并有明显扩增曲线。否则实验视为无效。
结果报告
当同时进行的阳性、阴性和空白对照实验结果正常，本方法检验结果判定如下：检测样品有明显的荧光增幅曲线，且Ct值≤35时，判为阳性。一检测样品荧光增幅曲线的Ct值在35和40之间时，建议采用浓缩方式处理核酸样本，再重新进行实时荧光PCR检测。若重新检测的Ct值有明显的减少趋势，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，否则判为阴性。此类样本建议用其他方法进一步验证。检测样品无荧光增幅现象，判为阴性。LU
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