【商检行业标准(SN)】 大豆中转基因成分定性PCR检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1195—2003
大豆中转基因成分的定性PCR
检测方法
Protocol of the qualitative polymerase chain reaction (PCR)for detecting genetically modified component in soybeans2003-03-17 发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2003-09-01实施
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位，中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。本标准主要起草人：蒋原、祝长青、林宏。本标推系首次发布的检验检获行业标摊。SN/T1195-2003
1范圈
大互中转基因成分的定性PCR
检测方法
本标准规定了大豆中转基因成分的定性案合酶链式反应(PCR)检测方法。SN/T 1195—2003
本标准适用于大互中抗草廿麟转基因大豆(roundup ready gaybean)中的转基因成分的检测,2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其随后所有的能改单（不包括勘误的内容）或静订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准，GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T 1193基因检验实验室技术要求SN/T1194物及其产品转基因成分检测的抽样和制样方法SN/T1204植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法3术语,定义和留略语
下列术语,定义和缩略语适用于本标难。3. 1
转基因成分 genetlcally trodifhed component将物种本身不其有的、而是来源于其他物种的功能基国序列。3.2
聚合酶链式反成ploymerase chain reacthon (PCR)模板基因序列先经高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段五补库列发生退火而相互结合.接着在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物,使引物得以延伸,然后不断重复变性,退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以儿何倍数扩增。3.3缩略语
3.3.1Lectin;植物疑集素基因,为大豆本身含有的内源基因。3.3.2CaMV35S,35Spromoter from cauliflowermosaic virus,花棒菜花叶病毒35S启动子。3. 3. 3NOS: Tcrminator of nopaline synthase gene fram Agrobacterium tumefaciens,来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子。
3.3. 4CP4 EPSPS:5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene,5-醇丙酮酸荠草酸-3-磷酸合戒酶基因。
3.3.5RRSrnundupreadysoybean，美围Monsanto公司的获准商品化种植的抗除草剂草甘辨的转基因大豆,转人外源基因有 CaMV35S启动子,NOS终止子和 CP4-EPSPS基因等。1
SN/T 1195--2003
4防污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施按照 SN/T 1193中的规定执行。5轴样和制样
5.1抽样
按照 SV/T 1194 中规定的方法执行。5.2制样
称取约50 g大豆样品，用湿热灭菌(121℃处理 30min)或干热灭菌(180℃处理2 h)的研体或合适的粉碎装置将样品粉碎至约 0.5 mm左右。6测定方法
6. 1原理
根据RRS转基因大豆生物基因组中含有的外源基因序列设计山特异性引物，利用PCR片潜对这段外源基因的序列片段进行扩增,根据实验结果来判定被检样品的核酸中是否含有RRS 的转基因成分。
6. 2 试剂和材料
除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂。6. 2. 1 CTAB缓液,CTAB 20g/L,Tris-HCI 0. 1 mol/L(pH8. 0),EDTA 0. 02 mol/L.6.2.2
Tris 饱和酶。
三氯甲烷：异戊醇（24：1)。
异丙醇。
6. 2. 5 70%乙醇。
6. 2. 6TE 游液(lo mmol/L Tris,1 mnmol/L EDTA+pH8. 0).6. 2.71
RNA酶溶液:5 μg/μL-
10XPCR反应镀。
氯化镁（MgClg）,25 mmo1/L。
rNTP(dATP,dCTP.dCTP,dIUJTP>游液,各 2. 5 mmrl/L。Tag 酶.5 U/μL.
引物;转基因大豆的内源基因和外源基因检测时所用的引物序列见表1。装1转基因大豆的内源基因和外源基因的引物序列检测基固
Leetit
CaMV35S
CP4 EPSPS
引物序列
IF.,5' -gce ete lac ter μrce ccc ate c -3反:5* -gcc cat ctg caa gce ttt ttg tg -3\E:s' -1gc cg agc aac caa aca tgu tcc t-3'反,5' -tgh thh 4lc tga tag aat tga cg1 t-3'正, 5' -gat agt ysb att gig cgt we-3反,5 -gct cet aca aat gcc atr a 3\正5* -geu tcu tgt 4gc cgg 1c1 tg-3反5' -ts tcc teg tt gcg cgc ta-3'正t5' -ctt ctg tgc tgt agc cac tga tge-3反i5' -cca cta tce tte gca aga cec tte c-3正,5'-cttcggar tcticeletta-3\反,5* -ate etk gcg ccc ata gc tgc atg-3\扩增片段长度
195 hp
基因性质
内颜基因
外源基因
外源基因
外源基因
6.2.13实验用水：按GB/T6682规定执行。6.2. 14 漠化乙锭(EB),10 mg/mL。6.2、[5DNA分子量标记物，
6.2.16琼糖。
SN/T1195—2003
6.2.1750×TAE缓冲液：242gTris碱，57.1ml冰乙酸，100mL0.5mol/LEVTA(pH8.0)。上样缓冲液。
6. 2. 19 RRS 标样,非转基因大豆标样。l. 5 mL 离心管。
滋芯吸头10μ.20μL100μ200μ,1000μ)。PCR 反应管<200 μL)。
6. 3主要仪疆
电子天平(磁量为0.001g)。
恒温孵育装量
普通离心机，低温冷冻高速再心机，微型离心机研体及粉碎装置。
低温冰箱，普通冰箱。
旋蜗无步器。
商压灭菌器，
高温干爆箱。
核酸蛋白分析仪。
微量移波器(0. 5 μI,,2 μL,10 μL,20 μL,100 μL,200 μL,1 000 μL)。革因扩增仪。
电泳仪。
凝胶成像分析系统。
实时荧光PCR仪。
超争工作台。
6. 3. 16实验用水制备装置。
6. 4检测方法
6. 4. 1样品的 DNA 提取
6. 4. 1. 1 CTAB方法
6.4.1.1.1分别称取100m制备好的样品，各加入到两支1.5mL离心管中，同时设立试剂提取对照。
6. 4. 1. 1. 2 加人 600 μL CTAB缓冲液,振满均勾,65C溢育 30 min。6.4.1.1.3加人500μL酸：三氟甲烷异戊醇（251241)，握满均勾，12000z/min离心15min，6. 4. 1. 1. 4
吸取上清液,放人男一新管中,加人等体积的异丙醇,12 000 r/min 离心 10 min。奔去上清液，加人70%乙醇溶液洗漆，12000r/min离心1min。6.4. 1. 1.5
6. 4. 1. 1. 6
6. 4. 1. 1.7
6. 4. 1. 1. 8
弃去上清液,于燥,用 50 μL TE溶液溶解沉淀。加人 5 μL RNA 酶溶液,37C温育 30 min。加人 400 μL的CTAB溶液,握荡均勾。6. 4. 1. 1. 9加人 250 μL的三氧甲烷1异醇,娠荡均勾,12 000 z/min离心 15 min。吸取上清液，放人另一新管中，加人200μl.的异丙醇，12000r/min离心10min。6. 4. 1. 1. 10[
6. 4. 1. 1. 11
弃去上清液，干燥,用 50 μL TE缓神液溶解沉淀。6. 4.. 2商品化试意方法
SN/T 1195-2003
根据不同提取原理的商品化基因组提取试剂盒，使用时按履操作说明书进行操作。选择商品化试剂盆的原则是所提取 DNA 质量好并且得率高。6. 4. 1. 3所提取样品 DNA 的质量评估6. 4. 1. 3. 1方法 1
样品中提取的 INA用核酸蛋白分析仪测定,分别计算接酸的纯度和浓度,计算公式见(1)式。·DNA纯度=
比值在1.7~2.0之间较好，符合PCR检测要求，QDzonm
ODrsonm
DNA 浓度根据 1ODz0n -=50 μg/ m. 双链 DNA 或 38 μg/ mL 单链 DNA,估算出浓度。6. 4. 1. 3. 2 方法 2
用1%的凝胶电泳进行检测,具体的操作步骤见6.4.2. 4的凝胶电泳检测部分，根据电泳结果来检测提取的 DNA，
6. 4. 1. 3. 3方法 3
通过定性 PCR来检测大豆样品的固有内源基因 Lec:Lin,根据检测结果来判定样品中提取的 INA是否满足 PCR 检测要求,PCR 的反应体系见表 2,反应循环参数见表 3,其他操作要求按照 6. 4. 2 的定性PCR检测。
B. 4. 2定性 PCR 检测
6. 4. 2. 1PCR反应体系
检测RRS中内源和外源基因采用的PCR检测反应体系见表 2。反应体系中各试剂的量根据反应体系的总体积进行适当调整。每个反应体系应该设置两个平行管。表 2FCH检测参考反应体系(50 μL 体系)试剂名称
10XPCR 反应缓冲液
氯化镁(25 mmnl/L)
UNG 降(1 U/ μL)
dVTP将液(各为2. 5 mmol/1.)
正义引物（10pmol/L)
反义引物(10 pnol/μL)
Tag 酶( U/μL)
棋板（样品的DNA)
6. 4. 2. 2反应体系对服的设置加入PCR反应体系的量
0. 5 μg~3 μB
补足反应体系使总体积为 50 μL进行PCR检测时反应体系必须设暨阳性对照、阴性对照和密白对照。6. 4. 2. 2. 1 阳性对照:用 RRS标物提取的 DNA 作为模板。6.4.2.2.2阴性对照,用非转基因大豆标物提取的 DNA作为模板。6. 4. 2. 2. 3空白对照,用配置反应体系的实验用水代锌模板。6. 4. 2. 3KRS 中内源基固和外基因的检测RRS中内源基因和外源基因的PCR检测的参考反应条件见表3。反应条件需模据检测议器的性能做相应调整。
被扩增的基因
Lectin
CaMV35S
CP4 EPSPSbzxZ.net
衰 3RRS 中内通基因和外源基因的 PCR 检测的参考反应条件变
94℃,5 min
94℃,5 mim
94c,5min
6. 4. 2. 4凝胶电述检测 PCR 产物扩
54℃,40 g
72℃,60s
94℃.30 a
54C,40 s
72℃.60 a
94,30 s
60,60 s
72℃+60 s
循环次数
SN/T1195—2003
最后竭伸
72C.7 min
72℃,7 min
72,7min
用 1 × TAE(或 0. 5× TBE) 电泳缓冲液制备 2 %的琼脂糖凝胶(凝胶融化后凉至 60 亡在右时加人读化乙锭含量为0.5g/ml;或者在电泳后用溴化乙锭溶被进行染色。此外也可以选用其他染色剂）。按比例将10 μL的 PCR产物与上样缓冲液均勾混合,然后分别加人对应的凝胶孔中,间时加入合适的DNA 分子素标记物,选择合适的电压t3 V/cm~～5 V/cm)进行电脉,电泳时间为 20 min~40 min。用凝胶成像分析系统进行观察分析并记录。6.4.2.5结果分析与判定
6. 4. 2. 5. 1 根据内源基因 Lectin 扩增情况,来判断所提取的样品 DNA 的质量,必要时进行样品 DNA的纯化或者重新提取，防止出现检测中产生假阴性。6. 4. 2. 5. 2样品的内源基因 Lectin 扩划为阳性,样品的外源基因 CaMV35S 和外源基因 NOS 扩增为阳性，其相应的阳性对照、阴性对照和空白对照正确，可根据结果判定被检样品中含有CaMV35S和NOS转基因成分
如果外基固 CP4 EPSPS 的扩增结果同时也为阳性,其相应的阴性对照和空白对照均正确,可以期定此样品为RRS.
6. 4. 2. 5. 3 样品的内源基因 Lectin 扩增为阳性,样品的外源基因 CaMV35S、NOS 或 CP4 EPSPS 中仅有一个为阳性，判定被检样品的检测结果可疑,应按照 SN/T 1204 中规定的方法进行确证实验。5
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