【商检行业标准(SN)】 化妆品微生物检验方法 第5部分：肠球菌

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2206.5—2009
化妆品微生物检验方法
第5部分：肠球菌
Determination of microbiological in cosmetics-Part5：Enterococci
2009-02-20发布wwW.bzxz.Net
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2009-09-01实施
SN/T2206《化妆品微生物检验方法》分为以下部分：第1部分：沙门氏菌；
第2部分：需氧芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌；第3部分：肺炎克雷伯氏菌；
第4部分：链球菌；
第5部分：肠球菌。
本部分为SN/T2206的第5部分。
本部分的附录B为规范性附录，附录A、附录C和附录D为资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T 2206.5—2009
本部分起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。
本部分主要起草人：杨捷琳、顾鸣、袁辰刚、李晓虹、朱海。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准I
1范围
化妆品微生物检验方法
第5部分：肠球菌
SN/T2206的本部分规定了化妆品中肠球菌的检验方法。本部分适用于化妆品中肠球菌的检验。2规范性引用文件
SN/T2206.5—2009
下列文件中的条款通过SN/T2206的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T7918.1化妆品微生物标准检验方法总则
3术语和定义
下列术语和定义适用于SN/T2206的本部分3.1
肠球菌
Enterococci
类革兰氏阳性球菌，兼性厌氧，无芽孢和荚膜，可分解胆汗七叶苷。4材料和设备
4.1振荡器。
三角瓶：250mL。
4.3玻璃珠。
玻璃棒。
刻度吸管：1mL，10mL。
均质器。
恒温培养箱36℃±1℃，46℃±1℃.32.5℃±2.5℃。天平：感量为0.001g。
高压灭菌器。
培养基和试剂
5.1D/E中和培养基（Dey/Engley中和培养基），参见附录A第A.1章。5.2叠氮化钠葡萄糖肉汤，参见附录A第A.2章。5.3KF培养基（加中和剂）.参见附录A第A.3章。5.4Pfizer肠球菌选择性琼脂（PSE琼脂），参见附录A第A.4章。5.53%过氧化氢溶液。
5.6革兰氏染色液。
5.76.5%氯化钠葡萄糖琼脂，参见附录A第A.5章。1
SN/T2206.5-—2009
6检验程序
6.1化妆品中肠球菌MPN计数法检验流程图见图1。检样10g制成！：10样品稀释液
取1mL加入到氯化钠葡衡肉汤
36 11℃培养24 h12 h
确证实验
畅球菌阳性
肠球茵阴性
MIN法报告肠球菌效
化妆品中肠球菌MPN计数法检验流程图图1
2化妆品中肠球菌平板计数法流程图见图2。6.2
检样10g制减1：10样品稀液
10倍梯度稀释
选择~3个适宜连续稀释度，各取1ml.分别加入光菌培养ⅢKF琼脂
确让实验
肠球菌阳性
肠球菌计数及计算
结果报告
PS康脂
图2化妆品中肠球菌平板计数法流程图6.3样品制备
样品按照GB/T7918.1供检样品的制备方法进行。样品制备时，也可参见附录A第A.1章的D/E中和培养基代替生理盐水或SCDLP培养基。参见附录C中列出的化妆品中常用防腐剂种类及微生物检测时所使用的中和剂种类和配方，可根据不同产品成分参照使用。2
6.4最大近似数（MPN)法
SN/T2206.5—2009
6.4.1用适当稀释的样液接种叠氮化钠葡萄糖肉汤管，每个稀释度接种3管.接种量为1mL或1mL以下时，使用10mL单料管；接种量为10mL时使用10mL双料管，接种后的试管置36℃土1℃培养24h士2h，检查各试管浑浊情况，若浑浊不明显，继续培养至48h后记录。6.4.2培养24h士2h或48h士2h后，对所有呈现浑浊的叠氮化钠葡萄糖肉汤管进行确证，用接种环将各管培养物划线于Pfizer肠球菌选择性琼脂（PSE琼脂）平板或KF琼脂平板，倒置于36℃土1℃培养24h土2h。肠球菌属细菌在肠球菌琼脂平板上形成带棕色环的棕黑色菌落，在KF平板上形成暗红至粉红色菌落，边缘整齐；对典型或可疑菌落至少挑取10个按6.6进行确证实验。每管培养物中有一个菌落确认为肠球菌，则该管视为阳性6.4.3结果报告：根据接种的样品量和确证为肠球菌的管数，查MPN表（见附录B），报告每克（毫升）[g（mL)样品中肠球菌的MPN值
6.5平板计数法
6.5.1取1mL适当稀释的检液加人90mm×15mm的培养皿内倾注12mL～15mL已融化约45℃的KF琼脂或PSE琼脂培养基，转动培养血使培养基与样液混匀，待平板凝固后倒置于36℃主1℃增养24h士2h，每个稀释度接种两块平板。6.5.2菌落形态：肠球菌在KF琼脂平板上形成暗红色至粉红色菌落，在PSE琼脂平板上形成带棕色环的棕黑色菌落为典型或可疑菌落。6.5.3菌落计数及结果报告：对典型或可疑菌落挑取10个按6.6进行确证实验。选取25个250个确证为肠球菌菌落的平板进行计数，计算同一稀释度两个平板的平均菌落数，报告结果，6.6确证实验
6.6.1革兰氏染色：挑取上述可疑菌落，染色镜检，肠球菌为革兰氏阳性球菌，多数成双或呈短链状排列，无芽孢。
6.6.2过氧化氢酶实验：挑取固体培养基上典型或可疑菌落·置于洁净试管内，或涂于干净的载玻片上，然后分别滴加3%过氧化氢溶液2mL或一滴观察结果，于0.5min内产生气泡者为阳性，不产生气泡者为阴性，肠球菌为过氧化氢酶阴性。6.6.36.5%氯化钠葡萄糖培养：挑取单菌落接种6.5%氯化钠葡萄糖琼脂培养基，36℃士1℃培养24h土2h，观察是否生长。过氧化氢酶实验和6.5%氯化钠葡萄糖实验生长符合者判定为肠球菌属，可参照附录D进行进一步确证和分类。7中和剂验证
7.1微生物菌株
采用粪肠球菌（ATCC49452）或其他等同性菌株7.2验证实验
7.2.1接种物的制备
在测试前.用粪肠球菌（ATCC49452）接种KF琼脂培养基，32.5℃土2.5℃培养18h～24h。收集培养物，调整悬液浓度为108CFU/mL。注：在2h内使用制备的悬液和稀释液。7.2.2梯度稀释菌悬液，以获得100CFU/mL与500CFU/mL之间的浓度。为了计数调整的菌悬液中的活菌数量.移取1mL悬液放人平血内.混血法倾注平板，倒置32.5℃土2.5℃培养20h～24h计数。
7.2.3取样品1g或1mL，按照GB/T7918.1供检样品的方法1：10制备样液，无菌方式加人0.1mL调整好浓度的菌悬液，未添加细菌的样品作为对照7.2.4划线分离于添加中和剂（KF）和未添加中和剂（KF一）的KF平板，32.5℃王2.5℃培养3
SN/T2206.52009
20 h~24he
7.3验证结果的解释
如果KF（十）平板上有标准菌株生长，在KF（一）平板上不生长，中和剂的中和效果得以验证。当KF（十）和KF（一）上均有细菌生长，如果KF（十）生长菌株为添加的标准菌株时，中和剂和中和效果得以验证。在KF(+）和KF（一）无细菌生长或仅KF（-）有杂菌生长均表明抗菌活性仍然存在，应改变样品与培养基稀释比例，或改变中和剂配方，进一步选择合适的中和剂配方，验证中和效果附录A
（资料性附录）
培养基
A.1D/E中和培养基（Dey/Engley中和培养基）A.1.1成分
葡萄糖
大豆磷脂
五水硫代硫酸钠
聚山梨醇酯80
胰化酪蛋白
亚硫酸氢钠
醇酵母膏
β-硫基乙醇
溴甲酚紫
蒸馏水
pH7.3±0.1
2制法
1000mL
SN/T2206.5—2009
将各组分依次称取加人，加热后使之完全溶解，121℃灭菌15min，使用时，调节pH值至7.6士0.2。
叠氮化钠葡萄糖肉汤
牛肉浸膏
胰蛋白陈
葡萄糖
氯化钠
叠氮化钠（NaNs）
蒸馏水
A.2.2制法
1000mL
以上各成分混勾，不断加热搅拌溶解，用适当大小试管分装，每管10mL，121℃灭菌15min，若制备双料浓度，上述配方中蒸馏水改为500mL。KF培养基（加中和剂）
A.3.1成分
三号陈或多陈
酵母浸膏
氯化钠
甘油磷酸钠
SN/T2206.5—2009
麦芽糖
叠氮化钠
蒸馏水
卵磷脂
Tween80
pH7.0±0.2
2制法
1000ml
将各成分加热溶解，用10%碳酸钠调整pH值至7.2.121℃灭菌15min，冷却至50℃~60℃时加人无菌1%氯化三苯四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride）水溶液10mL。培养基于45℃～50℃倾注平板，凝固后保存于冰箱备用。A.4Pfizer肠球菌选择性琼脂（PSE琼脂）A.4.1
蛋白陈
酵母浸膏
细菌学用胆汁
氯化钠
柠檬酸钠
七叶苷（Esculin）
柠檬酸铁铵
叠氮化钠
蒸馏水
2制法
1000mL
121℃灭菌15min，灭菌后pH7.1,冷却后倾注平板56.5%氯化钠葡萄糖琼脂
A.5.1成分
胰蛋白陈
酵母浸膏
葡萄糖
氯化钠
溴甲酚紫
蒸馏水
A.5.2制法
1000ml
各成分溶解后，调节pH值为7.0，分装于13mmX130mm试管，121℃灭菌15min，斜置试管使成斜面。
SN/T2206.5—2009
附录B
（规范性附录）
MPN表
B.11g样品中最可能数（MPN)表
使用三管法，接种量为0.1.0.01.0.001(mL），见表B.1。表B.1MPN表
阳性管数
SN/T2206.5-2009
表B.1（续）
阳性管数
注：表内所列样品量如改为1,0.1.0.01g（mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改为0.01.0.001.0.0001g（mL)时，则表内数字相应增加10倍·其余可类推8
防腐剂
酚类化合物
对羟基苯甲酸酯，
苯基乙醇，
季胺类化合物，阳
离子表面活性剂
氧化物
异噻唑啉酮，咪唑
金属盐类（Cu，Zn
有机汞类
附录C
（资料性附录）
防腐剂对应使用中和剂清单
中和剂
防腐剂对应使用中和剂清单
SN/T2206.5—2009
中和剂及漂洗液配方（膜过滤法）聚山梨醇酯80.30g/L+卵磷脂，3g/L卵磷脂，聚山梨醇酯80，脂
肪酸环氧乙烷聚合物，非离子
型表面活性剂
卵磷脂，皂角苷，聚山梨醇
酯80.十二烷基硫酸钠，脂肪
酸环氧乙烷聚合物
甘氨酸.组氨酸
硫代硫酸钠
卵磷脂，皂角苷，胺，硫醇，
亚硫酸氢钠,β巯基乙醇
卵磷脂，皂角苷，聚山梨醇
重硫酸钠，
L-硫基半胱氨酸，
巯基乙醇
脂肪酸环氧乙烷聚合物，7g/L+卵磷脂，20g/L+聚山梨醇酯80.4g/L。
D/E中和培养基a
漂洗液：蒸馏水；蛋白陈，1g/L+氯化钠，9g/L：聚山梨醇酯80.5g/L。
聚山梨醇酯80.30g/L+十二烷基硫酸钠，4g/L+卵磷脂，3g/L.
聚山梨醇酯80.30g/L+皂角苷，30g/L+卵磷脂，3g/L。D/E中和培养基a
漂洗液：蒸馏水，蛋白陈，1g/L十氯化钠，9g/L；聚山梨醇酯80.5g/L。
卵磷脂，3g/L+聚山梨醇酯80.30g/L+L-组氨酸，1g/L聚山梨醇酯8030g/L+皂角苷，30g/L+L组氨酸，1g/L+L-半胱氨酸.1g/L。
D/E中和培养基a
漂洗液：聚山梨醇酯80.3g/L+L-组氨酸，0.5g/L硫代硫酸钠，5g/L。
漂洗液：硫代硫酸钠，3g/L。
聚山梨醇酯80.30g/L+皂角苷，30g/L+卵磷脂，3g/L。漂洗液：蛋白陈，1g/L+氯化钠，9g/L：聚山梨醇酯80.5g/L。
聚山梨醇酯80.30g/L+皂角苷，30g/L+卵磷脂，3g/L。漂洗液：蛋白陈，1g/L+氯化钠，9g/L；聚山梨醇酯80.5g/L。
β巯基乙醇，0.5g/L或5g/L
L-半胱氨酸，0.8g/L或1.5g/L
D/E中和培养基a
漂洗液：β琉基乙醇，0.5g/L。9
SN/T2206.5-—2009
甘露醇
附录D
肠球菌属主要生化特性
肠球菌属主要生化特性
（资料性附录）
阿拉伯糖
山梨醇
鸟肠球菌
粪肠球菌
屎肠球菌
鸡肠球菌
棉糖肠球菌
恶臭肠球菌
假鸟肠球菌
精氨酸
棉子糖
溶血性
注：（+）大多数菌株阳性，（一）大多数菌株阴性，V为不定，？为不明+
孤立肠球菌
酪黄肠球菌
芒地肠球菌
坚忍肠球菌
希啦肠球菌
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