【SN商检标准】 猪及其产品中特定转基因成分实时定量PCR检测方法

本网站 发布时间: 2024-07-10 19:05:28
  • SN/T 4737-2016
  • 现行

基本信息

  • 标准号:

    SN/T 4737-2016

  • 标准名称:

    猪及其产品中特定转基因成分实时定量PCR检测方法

  • 标准类别:

    商检行业标准(SN)

  • 标准状态:

    现行
  • 出版语种:

    简体中文
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SN/T 4737-2016.Protocol of the real-time PCR for detecting genetically modified component in pigs and their derived products.
1范围
SN/T 4737规定了猪及其产品中特定转基因成分的实时定量PCR检测方法。
SN/T 4737适用于转脂肪酸去饱和酶基因、转植酸酶基因、肌肉生长抑制素基因敲除猪及其产品的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.2转基因产品检测实验室技术要求
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
APPA:植酸酶( Phytase)
MSTN:肌肉生长抑制素(Myostain)
PCR:聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)
sFat-1:w-3脂肪酸去饱和酶基因(omega-3 faty acid desaturase)
TE: Tris-HCl.EDTA缓冲液
4防污染措施
猪及其产品中特定转基因成分实时定量PCR检测过程的防污染措施应符合GB/T 19495.2 的规定。
5实时定量PCR试验
5.1 主要仪器
5.1.1实时荧光定量 PCR仪。
5.1.2 超净工作台。
5.1.3 消毒灭菌锅。

标准内容标准内容

部分标准内容:

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4737—2016
猪及其产品中特定转基因成分
实时定量PCR检测方法
Protocol of the real-time PCR for detecting genetically modified component inpigs and their derived products2016-12-12发布
中华人民共和国
玉家质量监督检验检疫总局
2017-07-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4737-—2016
本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中国农业科学研究院北京畜牧兽医研究所、中华人民共和国山东出入境检验检疫局
本标准主要起草人:林祥梅、王勤、李晓琳、朱振营、刘建、李奎、潘登科、孙敏、付伟、刘晓飞、梅琳、刘丹丹、仇松寅。
1范围
猪及其产品中特定转基因成分
实时定量PCR检测方法
本标准规定了猪及其产品中特定转基因成分的实时定量PCR检测方法。SN/T47372016
本标准适用于转脂肪酸去饱和酶基因转植酸酶基因、肌肉生长抑制素基因敲除猪及其产品的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修尊单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
APPA:植酸酶(Phytase)
实验室技术要求
MSTN:肌肉生长抑制素(Myostatin)PCR:聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction)
sFat-l:w-3脂肪酸去饱和酶基因(omeg)ta-3fattyaciddesaturase
TE:Tris-HCI、EDTA缓冲液
4防污染措施
猪及其产品中特定转基因成分实时定量PCR检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定。
5实时定量PCR试验
5.1主要仪器
实时荧光定量PCR仪。
超净工作台。
消毒灭菌锅。
核酸蛋白分析仪。
高速冷冻离心机,台式小型离心机,Mini个人离心机。低温冰箱,冷藏冷冻冰箱。
SN/T4737-—2016
纯水器,双蒸水器。
漩涡震荡器。
微量进样器:2.5L、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL。5.2主要试剂
实验用水:符合GB/T6682中一级水的规格。5.2.2
!TaqDNA聚合酶,三氯甲烷,异丙醇,异戊醇,70%乙醇,TE缓冲液,50倍TAE电泳浓缩缓冲液,细胞裂解缓冲液,蛋白酶K,醋酸钠(NaAc)。药品及试剂配制方法见附录A。5.3引物和探针
按照表1中提供的引物和探针序列合成引物及探针,配制成10pmol/μL用于PCR检测,扩增序列参见附录B。
表1检测转基因猪内外基因所需的引物序列被检测基因
Susβ2M
sFat-1
基因来源
猪内源
5.4试验步骤
5.4.1样品采集
引物序列
S'GAAGGTTCAGGTTTACTCACG3
STCAGCAAATCAATTTCAATCTG3
探针序列
5'CCCAGCGGAAAACGG
AAAGCCAA3
G'AGGGTAGGAAAGTGATTCAGGATCT35'TGCAGGTCAATTCT'CAGACTGCCTTGGGAAAAGC3
5'TGTTCGTTGGCAGGTTTTAC3\
5'AGATGGCTGGCAACTAGAAG3
STGTACGAGGCTGATGAATGG3'
5'TGTCCGTCTGTGATATGGTG3
5'TGAATGAAGCACGCA
TACCGGC3
5'TGTGTCCAATCCGAGT
CCATAGTAACGA3
采集动物的组织块作为检测样品,将其放入无菌Eppendorf管中,编号备用。采集过程中样品不得交叉污染,采集及样品前处理过程中应戴一次性手套。5.4.2样品存放
对于采集的样品放置在一70℃冰箱或液氮中,但应避免反复冻融(最多冻融3次)。5.4.3样品核酸的提取
内参照
MSTN基因
敲除猪检测
转植酸酶
基因猪检测
转W-3脂
肪酸去饱和酶
基因检测
5.4.3.1取新鲜或冰冻动物组织块0.1g(0.5cm),尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中,加人1mL的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块,转人1.5mL离心管中,加人蛋白酶K(20mg/mL)和胰RNA酶(20mg/mL)各5uL,混勾。在65℃恒温水浴锅中水浴30min,也可转人37℃水浴12h24h,间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000r/min离心5min,取上清液转人另一离心管中。5.4.3.2加2倍体积异丙醇,倒转混匀后,可以看见丝状物,用100uL吸头挑出,晾干,用200LTE重新溶解(可进行PCR反应等,需要进一步纯化的按下列步骤进行)5.4.3.3加等量的酚:三氯甲烷:异戊醇(25:24:1)至上清液中,振荡混勾,离心12000r/min,2
-irKAoNiKAca
5min。bzxZ.net
SN/T4737—2016
取上层溶液至另一管,加人等体积的三氯甲烷,异戊醇(24:1),振荡混勾,离心12000r/min,5.4.3.4
5min。
取上层溶液至另一管,加人1/10体积的3mol/LNaAc(pH5.2),加入2倍体积的无水乙醇,混匀后室温沉淀2min,离心12000r/min,10min。小心倒掉上清液,将离心管倒置于吸水纸上,将附于管壁的残余液滴除掉。5.4.3.6
用1mL70%乙醇洗涤沉淀物1次,离心12000r/min,5min。5.4.3.7
小心倒掉上清液,将离心管倒置于吸水纸上,将附于管壁的残余液滴除掉,室温干燥。加100uLTE重新溶解沉淀物。
5.4.3.10也可采用其他等效的商业化试剂盒。5.4.4阴性对照、阳性对照和空自对照的设置阴性对照:非转基因猪及其加工产品。阳性对照:阳性转基因猪及其加工产品。空白对照:设两个,一是提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品),二是PCR反应的空白对照(以水代替DNA模板)。
5.4.5实时定量PCR反应体系
实时定量PCR反应体系见表2,每个样品各做两个平行管。加样时应使样品DNA落液完全落入反应液中,离心机离心使溶液落于反应管底部。表2实时定量PCR反应体系
试剂名称
TaqMan探针法预混液
引物(上游)
引物(下游)
DNA模板
补水至
使用浓度
10pmol/μL
10pmol/μl
10pmol/μL
(20 ng/μL~30ng/μL)
注:表中DNA模板为原料的模板量,加工产品可视加工程度适当增加模板量5.4.6实时定量PCR反应参数
25μl反应体系加样体积/μl
1μ~2μ
预变性95℃.3min;95℃,5s.59℃,15s,72℃,15s,40个循环。不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。
5.4.7仪器检测通道的选择
PCR反应管荧光信号收集的设置,应与探针所标记的报告基团(可自由选择报告基团或者淬灭基团)一致,报告基团为FAM时,荧光信号收集应设在FAM通道;报告基团为HEX时,荧光信号收集应设在HEX通道:余类推,率灭基团为TAMRA。具体设置方法因仪器而异,可参照仪器使用说明书KAONKAca
SN/T4737-2016
5.4.8实时定量PCR反应运行
按预先设定的样品摆放顺序将PCR反应管依次摆放(上机前注意检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质泄露污染仪器),开始运行仪器进行实时荧光定量PCR反应。5.5结果分析
5.5.1结果分析条件设定
阅值设定原则:根据仪器噪声情况进行调整,以阅值线刚好超过阴性对照样品扩增曲线的最高点,且相交于阳性对照扩增曲线的指数增长期为准。5.5.2实时定量PCR检验的质量控制空白对照:内参照基因检测Ct值大于或等于40.并且无特定扩增曲线。阴性对照:内参照基因检测Ct值小于30,外源基因检测Cz值大于或等于40,并且无特定扩增曲线。
阳性对照:内参照基因检测Ct值<30.外源基因检测C值小于或等于34,并且出现特定扩增曲线。
上述指标有一项不符合者,应重做5.5.3结果描述与判定
在空白对照、阴性对照和阳性对照日阴性:待测样品外源基因检测Ct值大于或等于40,阳性:待测样品外源基因检测Ct值小于或等于
可疑:待测样品外源基因检测Ct值在3定核样晶不含有相应基因。
36.判定该样品含有相应基因。
~40之闻,判为可疑:可疑样品应重做,重做结果Ct值大于40为该样品不含有相应基因,否则判定该样品含有相应基因-TTKAoNiKAca
A.11mol/LTris-HCI缓冲液(pH8.0)附录A
(规范性附录)
药品及试剂配制方法
SN/T4737—2016
称取121.1gTris,溶于800mL双蒸水中,加人浓盐酸(浓度为138%的盐酸溶液)42mL,冷却至室温,用浓度为10%的盐酸溶液准确调节PH至8.0.加双蒸水定容至A.2500mmol/LEDTA(pH8.0
L,分装后高压灭菌备用。
在800mL水中加人186.1gEDTA-Na:2HIO.用磁力搅拌器剧烈搅拌至完全溶解,用氢氧化钠调节溶液pH至8.0(约需20g氢氧化钠颗粒),然后加双蒸水定容至1L,分装后高压灭菌备用。A.3TE缓冲液
量取1mol/LTris-HCl缓冲液
mot/LEDTA(pH8.0)1mL500mL烧杯中,向烧杯中加入约400mL双蒸水均勾混合,将溶液定容到500mL后,高温高压灭菌,空温保存。A.4酚:三氯甲烷:异戊醇(25
将Tris-HCl平衡苯酚与等体积的三氯甲烷/异戊醇(24
1)混合均勾后,移入棕色玻璃瓶中4℃保存。
A.550倍TAE电泳浓缩缓冲液
配制方法为取Tris242g冰醋酸57.1mL、0.5mol/LEDTA10mL,用5mol/L的HCl调制pH8.0,定容至1000mL。用前用双蒸水50倍稀释即可。A.63mol/L(NaAc)溶液
称40.8g的NaAc·3H,0加40mL去离子水溶解,用冰醋酸调节pH至5.2,最后定容至100mL。A.710%SDS
称取100gSDS加入900mL灭菌双蒸水中,68℃助溶,用浓HCI调节pH至7.2,定容至1L。A.85mol/LNaCI
称取58.4gNaCl溶于150mL灭菌双蒸水中,加水定容至200mL,高压灭菌,室温保存。5
rrKAoNiKAca
SN/T4737-2016
动物组织裂解缓冲液
量取1mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)10mL,500mmol/LEDTA(pH8.0)10mL5mol/LNaCl30mL,10%SDS100mL~800mL(pH8.0)灭菌双蒸水中用5mol/L的HCl调制pH8.0,定容至1000mL
蛋白酶K
称取20mg蛋白酶K溶于1mL灭菌的双蒸水中,-20℃备用。A.11
胰RNA酶
称取20mg胰RNA酶溶于1mL灭菌的双蒸水中,-20℃备用。iiKAoNiKAca
附录B
(资料性附录)
实时定量PCR扩增的DNA序列
B.1猪β2M基因序列(GenBank:AF452448.1.3790-4006),SN/T4737—2016
GAAGGTTCAGGTTTACTCACGCCACCCAGCGGAAAACGGAAAGCCAAATTACCTGAACTGCTATGTATCTGGGTTCCATCCGCCCCAGATTGAAATTGATTTGCTGAB.2
转植酸酶基因猪实时定量PCR扩增的DNA序列TGTTCGTTGGCAGGTTTTACGCAAATCGTGAATGAAGCACGCATACCCGCTTGCAGTTTGTAAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTB.3转0-3脂肪酸去饱和酶基因猪实时定量PCR扩增的DNA序列TGTACGAGGCTGATGAATGGAGCTTCGTCCGTGGACAAACCCAAACCATCGATCGTTACTATGGACTCGGATTGGACACAACGATGCGCACCATATCACAGACGGACAB.4
肌肉生长抑制素基因敲除猪实时定量PCR扩增的DNA序列AGGGTAGGAAAGTGATTCAGGATCTATTGCTCGAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGTCGAGGGCCCCTGCAGGTCAATTCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTG
SN/T4737-2016
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
猪及其产品中特定转基因成分
实时定量PCR检测方法
SN/T4737-—2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(100045)总编室:(010)68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16
印张0.75
字数16千字
2017年12月第一版
2017年12月第次印刷
印数1—500
书号:155066·2-32380
定价16.00元
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