【国家标准(GB)】 动物源性饲料中狗源性成分定性检测方法 PCR方法

ICS 65. 120
中华人民共和国国家标准
GB/T21105-—2007
动物源性饲料中狗源性成分定性PCR方法
检测方法
Identification of Canis derived materials in animal-originatedfeedstuffs-PCR method
2007-10-24发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-04-01实施
本标准的附录A为资料性附录。
木标推出中华人民共和国国家质量监督检验检毅总局提出。本标推由全国饲料工业标准化技术委员会归口，GB/T 21105—2007
本标推起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中毕人民共和国深圳出人境检验检疫局，本标推主要起草人：高宏伟,梁成珠、王岩、于立新、徐宝梁、陈颖、吴亚君、宗卉、温燕辉、曹际娟。本标推首欲发布，
1范围
动物源性饲料中狗源性成分定性检测方法
PCR方法
GB/T21105—2007
本标准规定了动物源性饲料中拘（Canis）源性成分检测的PCR方法，该检测方法的检出限为0.1%
本标准适用手动物源性饲料中狗源性成分的定性检测。INA
规范性引用文件
本标准的条部
下列文件中的餐欢过本标准的引用而成为本
凡是注口期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括动误的内容）或修计版均不适用鼓励根据本标准达成协议的各方研究本标准，然而，
是否可使用这些
GB6682
GB/T146
SN/T119
最新版本
凡是不注日期
新版本造用于本标准。
的引用文件，其最
验室用水规格和试验方法
饲料采样（GB/
14699.1-2005ISO64S7.2002.IDT因检验实验室技术
术语和定义
下列术语
文适用于本准
聚合酶链式
用于扩增位
DNA经过高温变
rcaction:PCR
polymerase chain
设已知序刻之向DNA
leoxyi
acid，脱率核糖核酸）的方法。模板sonucleosidea
单链，在DNA聚合静和适直的温度下，两条互不互补的宴核苷酸片段即弓物分别与模板DNA两
oxyribonucleoside
和DNA合成这一球
循环，扩增倍数达到约
4原理
大·接者在DNA
安互补序列发生道
氨核苷酸三
聚合酷的催化下以4种dNTP(de-
为底物，使摄火引物得以延伸，如此反复变性，退火两段已知序列之间的DNA片段呈几河倍数增，经25个～30个扩增利用裂解液破碎细胞，三氧甲烧抽提蛋白质，异丙醇沉流得到DNA；以提取的DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物PCR阳性产物应用限制性内切酶酶切反应进行确证。5试剂和材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB6682 的要求。5.1狗源性成分检测用引物（对）序列为：canisF:5-TCCAGGTAAACCCTTCTT-3canisR.5-TACGAGCAAGGGTTGATGG35.2TagDNA聚合酶（Tay，Thermusaquaticu，水生栖热菌）5.3限制性内切酶：IIphI酶。
5.4dNTPs:dATP(dcaxyadcnosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸）dTTP(deoxythymidinetriphos1
GB/T 21105—2007
phate,脱氧胸苷三磷酸）,dCTP(deoxycytidine triphosphatc,脱氧胞苷三磷酸）,dGTP(denxyguanosinetriphosphate，脱氨鸟苷三磷酸）。5.5琼脂糖：电泳。
5.6浣化乙锭。
5.7 三氯甲烷。
5.8异丙醇。
5.9 70%乙醇。
5. 10分子量标准品(100 bp ~2000 bp)(hp:buse pair,碱基对）5.11製解液：1%CTAB（celyltrithylamnoniumhromide，十六烷基三甲基漠化铵），0.05mol/LTris-IICl(plI8.0)[Tris-：tris（hydroxymethyl)aminomethane，三（羟甲基）氢基甲烷],0.7mol/1.NaCl，0. 0l mol/L EDTA (pH8.0)(ethylenc diaminetetraacetic acid,Z二胺四Z酸)。5. 12 TE 绥冲液(Tris-HCI, EDTA 缓冲液):10 mmol/L Tris-HCl (pH8. 0), 1 mmol/L EDTA(pH8,0).
5.1310×PCR缓冲液：100mmol/LKCl,160mmol/L(NH,),SO.20mol/LMgSO.200mmol/lTris-HCl（pH8.8），1%TritonX-1oo（t-octylphenoxypolyethoxyethanol，辛基茉氧基聚乙氛乙醇），1 mg/mL BSA(bovine serum alburmin,牛血清蛋)。5.14电泳缓冲液：Thig54g，硼酸27.50.5mol/LTE缓冲液（pH8.0）20ml加蒸馏水至1000mL；使用时 10 错稀释。
5.15澳化艺锭贮存液：用水配制或10mg/mL。5.16加样缓冲液：0.25%漠酚蓝40%（质量浓度）蔗糖水搭液。5. 17酵切缓p液:10 mmol/L THis-HCl (pH7. 5),10 rnmol/L MgCl2 ,50 mmol/L, NaCl,0. 1 mg/mL BSA。6仪器设备
DNA 热循环仪。
6.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.3恒温水浴锅。
6.4离心机：离心力12000g
6.5 微量移液器。
6.6电仪，
6.7紫外检测仪。
6.8 pH计.
6.9天平：感量0.01g：
7试样选取与制备
按照GB/T14699.1采样，将实验室样品粉碎，充分混合内句后待用：8检验步骤
8.1样品的总DNA据取
称取适量伺料（何料粒度为100日称取50mg：60日称取100ng;20自称取200mg）于1.5mL离心管中，加人600μL~800L裂解液，65℃30it,期间不时振荡混勾;12000多离心5min:转移上清于洁净离心管中,加400 μL三氯甲烷+异戊醇(24+1),混勾:12 000 g离心5 min,取上清液;加0.8 倍体积导丙醇,沉淀;12 000 g离心5 min,弃上消液;70%乙醇洗涤一次,晾干;加入 50 μL TE,溶解沉淀。也用等效IVA提取试剂盒提取模板DNA2
B.2DNA 浓度和纯度的测定
GB/T 21105--2007
取5μLLDNA溶液加双蒸水稀释至1mI.使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A2o和A28：DNA的浓度按式（1)计算：c=AXNX50/1000
式中，
-DNA液度，单位为微克每微升（μg/ul)；A—-260 nm 处的吸光值：
N核酸稀释倍数,
当A2/A2sa比值在1.7-1.9之间时，适宜于PCR扩增。8.3 PCR扩增
25pL的反应体系，在0.2mL的PCR反应管中，物canisF和canisR各200nnol/L10×PCR反应缓冲液2tmmol/1.MgClg.200nmol/LdVTPs，1.5LTTagDNA案合酶，1.0μLDNA馍板（100士50ngDNA）。设立陷性对履、阴性对照，空白对照组。PCR反应条件随仪器不同略有改变，一般的反应程序为：94℃预变性3min。94℃变性45s，56℃退火45e72℃延伸45s，35个循环。72℃延伸5min4℃保存。检测过中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照，用已知含狗源性成分的样品作阳性对照，用已知不含狗源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照。8.4PCR扩增产物电泳检测
取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/ml，制胶。在电泳槽中圳入电泳缓冲液，使液面刚刚没过胶，将5uL~8PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合·点样。9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。紫外检测仪下观察电泳结果并记录。
8.5限制性内切酶酶切及产物电泳检测如果PCR扩增产物电泳检测结果阳性，进行限制性内切酶酶切反应。反应体系（20μL）：HphI酶2C，酶切缓冲液2uL加入PCR扩增产物垒总体积20μL。酶切在37℃下进行，20min。酵切完成后电泳，方法见8.4。9 结果判断与表述
9.1PCR扩增产物电泳检测结果
阳性样品的PCR扩增产物大小为213bp（序列参考附录A)。9.2限制性内切酶酶切结果
阳性样品PCR产物采用内切酶HphI嗨切后，酶切片段大小为179bp和34hp9. 3结果表述
PCR产物和酶切产物都为阳性者判为含有狗源性成分，表述为检出狗源性成分；PCR产物为阴性者判为不含有狗源性成分，表述为未检出狗源性成分。10检测过程中防止交叉污染的措施按照SW/T1193执行。
11废弃物处理
检测过程中的废弃物.收集后在楚烧炉中烧处理。GB/T 21105—2007
附录A
(资料性附录）
PCR产物测序结果
TCCAGGTAAA CCCTTCTTCC CTCCCTATG TACGTCGTGC ATTAATGGTT TGCXCAIGCATATAAGCAT GTACAIAATA TTATATCCTT ACATAGGACA TATTAACTCA ATCTCATAGTTCACTGATCT GTCAACAGTA AICGAATGCA TATCACTTAG TCCAATAAGG GCTTAAICACCATGOCTCGAGAAACCATCAACCCTTGCTCGTA版权专有侵权必究
书号1550661-30293
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