【国家标准(GB)】 动物源性饲料中兔源性成分定性检测方法 实时荧光PCR方法

ICS 65.120
中华人民共和国国家标准
GB/T 21102--2007
动物源性饲料中兔源性成分定性检测方法
实时荧光PCR方法
Idcntification of rabbit derived materials in animal-originated fecdstuffs-Real time PCR method
2007-10-24发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-04-01实施
本标雍由中华人民共和国自家质虽监督检输检疫总局提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归1。GB/T21102—2007
本标准土要起单位：中华人房共和国订宁非入境检验检疫局，案牛物工程（大连）有限公司，中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出人境检验检疫局，中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国上海山人境检验检疫局。本标准主要起草人帮秋月、李晶泉、土玉荐,徐昊，曹际娟，于爱丽、强舒亚、陈颊、徐宝梁,高宏伟、宗产、金东权。
本标准首次发布，
1范围
动物源性饲料中免源性成分定性检测方法实时荧光PCR方法
GB/T21102—2007
本标准规定了动物源性饲料中免源性成分实时炎光PCR检测方法，该检测方法的检出限为0.1%。
本标准适用于动物源性同料中免源性成分的定性检测2规范性引用文件
从通本标准的引用而成为本标准凡是注日期的引用文件，其随后所有下列文件中的条
木标准，然面，
的修改单（不包括势误能
鼓励根据本标准达成协议的各方研究月容）或修订版均不适用
是否可使用这些
GB6682
代的最新版之
凡是不注口期的引用文件·其最新版本适用于本标准。规格和试验方
验室用水
GB/T 14699.1
SN/T119bzxz.net
3术语和定义
下列术语
实时荧光
饲料采
4699.1-2095.1SO6497.2002,IT)因检验实验室技术要求
文适用于本标准
real time PCR
鞋式反应
实时荧光果
Ct值eycle
每个反应管内的信号达到设定的圆值时质的循环数
4原理
技术，根据线粒体DNA的细胞适素C氧化酶亚单位I（ceytochromeC采用TaqMan实时美光
oxidase subunit I ,cox 1)差上动物种间多态性的差异而进行兔源性成分鉴定。利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，异内酶沉淀得到 DNA，以提取的DNA为模板进行实时荧光PCR扩增。本标准应用多色荧光检测技术，采用多重PCR方法，将所用试剂配制成预混合形式，组建成实时荧光PCR免DNA检测试剂盒。对反应液中含有的两种不同荧光染料进行双通道同步检测，在同一反应管内对免的COXI基因及内参照基因同时进行扩增，并通过标记两种不同荧光物质6-羧基荧光素（6carboxyfluorescein，FAM）、5-六氯荧光素（5-hexachloro-fluorescein，HEx）的探针进行特异性杂交，两色荧光同步检测。其中，对内参照反应的检测，可以监控反应是否正常进行，防止假阴性结果。观察实时荧光PCR的增幅曲线，从而对饲料中兔源性成分进行快速检测。5 试剂与材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB6682的要求。5.1DNA提取用试剂
5.1.1三氯甲烷，
GB/T 21702--200/
5.1.2异成醇。
5. 1. 3 异内醇。
5.1.470%乙醇，
5，1.5裂解液：1%CTAR（cetyltrithylar.moriurbromide，f六烷基三于基换化铵），C.05mol/LTris-HCl(nHR.0)LTri-:tris（hydraxymethyl）aminomethane，（甲基）氢甲浣]，U.?mol/LNacl, 3. ol mol/L ELTA (H8. 0)(ethylene diamineiet:aacetic acid,Z二胺四Z酸).5.1.6TE爱冲液(Tris-HC1,EDTA缓冲液):10 mmnl/1.Tris-HCI（pH8.0),1 mmol/LELTA(pl18.0).
5. 2 实时荧光 PCR 兔 DNA 检测试剂盒5.2.12X免源性检视预混合液：含有ExTanFTS（终浓度1.25U/25uL).dNTPs（终浓度弃(. 4 mmnl/1),Mg+(终浓度 : rmel/1.).5.2.2免源性检测引物混合液：含有扩增免基因组I>NA及内参照的引物(序列详范表1),内参照(a LxA)。各引i物终浓度 u. I pμtiol/L--l. 0 μmol/L,表 兔及内茎照引物序列
兔引-引物
妞-引物
内参肌-引物
内照3-引
5'-TAATGGTEAGCGGACATGGG-3'
5'-CTATGTCAGGAGCCCCAATTATCA-35'-GGCIGAITGAUCGGCAGATTA 3'
5'-GGGGTATAGGTTTTATTCATGGC-35.2.3免源性检测探混个液：检测免基因组DNA的探计及检测内参照的探针（序列详见表?）。换针浓度与使用的实时丧产PCR扩增仪，荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说月书，或各光探针的具体使用要求进行，
表 2兔及内参照探针序列
负探针
内会照探计
S'(FAMACAAGEXAGTTCCCGAAGCCTCCA-3'(Ealiuse)5'(HEX)-CCGCCACGACGATGAACAGAOGCT -3'CEipse)5.2.4阳性对照:用已知含响乳动物源性成分的样品作阳性对照5.2.5双蒸水，
6仪嚣设备
6. 1 实时荧光 PCR 检测系统。6.2核龄蛋白分析仪或紫外分光光度亡。6.3电了天平感量C.0g.
6.4高心机：离心力12000。
6.5微量移液器:0.5 μL~10rL,1c μL.~100μ-,10μL.--200L,150 μL~-1 000 μ1..6. E 实时荧光 PCR 反应管。
6.7恒猛水欲箱。
7试祥选取与制备
按照GB/T14699.1采样，将实输室栏品粉碎.充分海合均匀后待用。8检验步骤
8,1样品的总LNA提取
GB/T21102—2007
称取适量饲料(何料粒度为100耳称取 50 nug;69目称取100 mg;20目称取200-g)于1,5mL离心管中，加人690L~80μ激解赖，G530min，每随13min振浪勺：12000r/min离心5rin，吸取上清液至~新离心管中，加400μL兰氯甲烷十异成醇（24十1），充分混匀;12000r/min离心smin，吸取上清液至一新离心管中，加0.8倍体积异丙醇，室蕴下沉淀1h-~2h,12000r/min离心J.min，弃上清液;70为乙醇洗涤一次;晾干;加人50 μL TE,溶解沉淀：也可用等效的 DNA 提取试剂盒提取模板 TINA。8.2TNA浓度和纯衰的测定
取5μLDNA游液加双蒸水稀至1ml，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260工m和280 nm 处的吸光值Aasc和 A20。DNA的浓度按式(1)计算：c-AXNX50/1000
武中：
c——DNA 浓度,单位为微克每微升(pμg/pL);A260证处的吸光值，
N—核酸稀释伴数。
当 Ao/A2 比值在 1. 7～1. 9之间时,适宜于 HCR扩增。8. 3实时荧光 PCR 检测
B,3.1反应体系的体积为25 μL,2×免源性检测项混合液加12. 5 μL,免源性检测引物混合液和兔源性检测探针视台液各加1μL,样品DNA(1g/μL～100ng/μL)1:L,双蒸水至25L。B, 3,2在各实险荧光PCR反应管中加入上述试剂后，益紧管,离心5s--10s。8.3. 3将离心启的实时荧光 PCR反应管放人实时费光 PCR检测系统内,记录栏本摆改颁序。8.3.4实时荧光PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不向进行适当的调整。-般节反应程序为：0510a,1个环，05℃5s.60它30s;40个循环，在每循环的退火时收崇荧光。8. 3. 5检测结束后:根据扩增曲线和 Ct 值判定结果。8. 3. 6 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含免源性成分的样品作阳性对照，用已知不含兔源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替供板DNA作空白对照。注：也可用等效的免源性或分实时获光 PCR 检测试剂点选行实时或光 PCR 检训。9结累判断与表递
9. 1 结果分析浆件设定
直接读敢检测结果。阅值设定原则根据仪器噪声情况进行调整。9. 2结果判定
9. 2. 1 对照结果
空白对照;无 FAM荧光信号检出。有 HEX荧光信号检出,Ct值应<_35. 0。阴性对照：无FAM荧光信号检出。有 HFX荧光信号检出,Ct值放.35,0。阳性对照:有 FAM 和 HFX荧光信号检出：耳FAM通道出现典型的扩增线.Ct值～28.0。否则，实验视为无效。
9.2.2检测结果的判定
Ct值35为有效值，C值35为无效值（详见表3）。CB/T 211C2—2C07
FAM荧光
9.3结果表述
HEX荧光
检出兔源性成分。
未检出兔源性成分，
表3结果的判定情况
结果判定情况
同时进行的勇进，阳性、家白对服实验结果正常，捡测实际样品时，如有下AM荧光和HEX荧光检山，可Ct直≤35,判定为含有兔源性或分：刻果Ct值>35可规问不含有免题性既分。
同时过行的阴性，用烂、空白对照实验纤乐正常，检测实原样品时，HEX荧光信号未检山，Ct宜>3如果检测样品来度高会抑利内参照DNA的扩增）：如只有FAM丧光检出，且C值≤35，判定为舍有免源件成分如果FAM荧光C值>33,百为不含有兔源性或分。
同时进行的明性、阳性、空白对照实验绪果正常，检测实样品时有HEX荧光检出，无FAM荧光检出，判定为不含有免源指成分。PCR反应失败。注意以儿个女丽后再次选行反应。Q如果同时进行的阳性对照实验结果正常·质可能是样品DNA制备有问顾，样品中可能存在 ICR 反应的抑制物等如果同时进行的陷性欢照实验结果不止常，则可能是实验操作失效或试剂失茄。
10检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193执行.
11废弃物处理
检测过程中的废弃物，收集后在获烧炉中烧处埋。版权专有侵权必究
书号：155065-1-31129
GB/T 21102-2007
定价：
Guile Jy nu
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