【国家标准(GB)】 动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法 实时荧光PCR方法

ICs 65.120
中华人民共和国国家标准
GB/T 21103—2007
动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法
实时荧光PCR方法
Identification of mammal derived materials in animal-originated fecdstuffs-Real time PCR method
2007-10-24发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-04-01实施
本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口GB/T21103—2007
本标推主要起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、宝生物工程（大连)有限公司、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检度局，中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国！海出人境检验检疫局，本标准主要起草人：曹际媚、李品泉、郑秋月，徐吴、张舒亚、于爱丽.王玉萍，陈颖、徐宝桑、高宏伟、宗卉、金东权。
本标准首谈发布。
动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法实时荧光PCR方法
GB/T21103—2007
本标准规定了动物源性饲料中哺乳动物源补成分（包括牛、绵羊、山羊、猪、兔、鹿，马、驴，狗、猫等）实时炭光PCR检测方法，该检测方法的检出限为 0.1%。本标准适用于动物源性词料中乳动物源性成分的定性检测，2、规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标的引用间成为本标的条款。凡是注口期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括励误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的方研究是香可便用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB6682分析实验室用水规格和试验方法GB/I 14699.1饲料采样(GB/T 14599.1 2005,ISO 6497:2002,IDT)SN/T1193基因检验实验室技术要求3术语和定义
下列术语和定义适用于本标谁。3. 1
实时荧光 PCR、real time PCR
实时荧光骤合酶链式反应。
Ct值cycletime
每个反应管内的荧光信号达到设定的阐值时所经历的循环数。4原理
采用 TagMan 实时荧光 PCR 技术，根据线粒体 DNA 的 12S 核糖体 RNA(12S ribosomal RNA,12S rRNA)基因上哺乳动物与非哺乳动物种间序列差异而进行哺乳动物调性成分鉴定。利用裂解液破碎细胞，三氧甲烷抽提蛋白质异丙醇沉淀得到 DNA,以提取的 DVA 为模板进行实时荧光 PCR扩增。以实时荧光检谢技术，采用多重PCR方法.将所用试剂配制成预混合形式，组建成实时荧光PCR哺乳动物 DNA检测试剂盒。在同一反应管内对哺乳动物的 I2S rRNA基因及内参照基因同时进行扩增,并通过标记两种不同荧光物质6-毅基费北素（6-carhonyfluorescein，FAM）5-六氯荧光素（5-hexachlo-ra-fltorescein，HFX)的探针进行特异性杂交，两色荧光同步检测。其中，对内参照反应的检测，可以监控反应是否正常进行防止阴性结果，观察实时荧光PCR的增幅曲线，从而对动物源性饲料中哺乳动物源性成分进行快速检测。
5 试剂与材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合安B6682的要求，GB/T21103—2007
5.1DNA提取用试剂
5.1.1三氯甲烷。
5.1.2异戊醇。
5.1.3异丙醇。
5.1.470%乙醇。
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5.1.5裂解液：1%CTAB（cetyltrithylaminoniumbromide，十六烷基三甲基漠化铵），0.05mol/LTris-HCl(pH8.0)Tris-：tris（hydroxymethyl)aminomethane，三（羟甲基）氨基甲烷0.7mol/LNaCl,0,o1mol/LEDTA(pH8.o)(ethylenediaminetetraacetiacid,Z二胺四乙酸)。5.1.6 TE缓冲液(Tris HCl,FTA缓冲液):10 mmol/L Tris-NCl (pH8. 0),1 mmo1/L EDTA(pIHI8.0).
5. 2 实时荧光 PCR 哺乳动物 DA检测试剂盒5.2. 1 2×哺乳动物源体检混合液含有 Ex Tag HS(表度/. 25 U)
检测引物混
5.2.2哺乳动物源
物烟组DNA
含有扩增哺乳
0.1 μmol/L~1.0
哺乳动物5-引物
哺乳动物5°引物
哺乳动物5-引物-3
哺乳动物5'-引物-4
哺乳动物5-引物-5
哺乳动物5-引物-6bZxz.net
哺乳动物3'-引物-1
哺乳动物3'-引物-2
内参照5-引物
内参照3-引物
浓度各0.
mmol/DMg（终浓度3mmol/L）。
内参照DN。
各引物终浓度
及内参照的引场（序列详见表1）乳动物及内参照引物序列
GCCATG-3'
5'-AGTGCTTAGTTGAATTAG
GTGOTTAAT
GCCATG-3
AGTGCTTGATTCAATAAGGCCATG-3
STAGAGC
5.2.3哺乳动物源性检测探针混合液FTGAATCA
GCCATG
GGGCCATOS
TTAATTGAATAGO
GCCA7G-3
5'-TCCAGTATGCTTACCTTGTTACGA-35'-TTACCTTGTTACGACTTOACTCCT
LGCCTGATTGACCGGCAGATTA-3
S-GCGGGTATAGGTTTTA
TGATGGC3
含有检测哺乳动物基因组DNA的探针及检测内参照的探针（序列详见表2）。探针浓度与使用的实时荧光PCR扩增仪，荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具休使用要求进行。
表2哺乳动物及内参照探针序列
哺乳动物探针
内参照探针
5'(FAM)-CGCACACACCGCCCGTCACCC-3'CEclipse)5'(HEX)-CCGCCACGACGATGAACAGACGCT-3(Eelipse)5.2.4阳性对照
用已知含哺乳动物源性成分的样品作阳性对照。5.2.5双蒸水。
6仪器与设备
6.1实时荧光PCR检测系统。
6.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计6.3电子天平：感量0.01g。
6.4离心机离心力12000
GB/T 21103—2007
10 mL,10L--100 mL,10 μL
200μL,10μL~1000μL.
6.5微量移液器0.5u
6.6实时荧光PCR反
6.7恒温水浴箱。
试样的选取与制
按照GB/T
8检验步骤
8.1DNA提取
称取适量
心管中，加人
5min，吸取上
采样，将实验室样品粉费充分混合均匀后待用。称取5cmgl60日称敢100mg：20目称取200mg）于1.5mL离饲料粒度为
裂料液，65℃-30min，期间每陷10min振荡混：12000t/min离心~800μ
1400L三氛甲烧
新高心管中加
异戊醇（24+1）充分混匀：12000-/min离加0.8倍体积异丙醇，空温下沉淀1h2h12000r/min离心心5min，吸取
10min，弃上清
至一新离心普中
艺醇洗浴
也可用等效
一次晾
：加入50
A提取试剂盒提取模板DNA
的测定
8.2DNA浓度和纯度
取5μLDNA
280nm处的吸光值
式中：
加双蒸水
稀释至
DNA的浓度技
TE.溶解沉淀。
更月核酸蛋白分析仪或案外分光光度计测260nm和(1)计算：
AXNX50/1000
DNA浓度，单位为微克每微升（ug/μL）；A
260nm处的吸光值
核酸稀释倍数。
当A20/A2%比值在1.7~1.9之间时，适宜于PCR扩增8.3实时荧光PCR检测
8.3.1反应体系的体积为25μL，2×哺乳动物源性检测预混合液加12.5μL，哺乳动物源性检测引物混合液和哺乳动物源性检测探针混合液各加1μL,样品DNA（1ng/μL~100ng/μL)1μL，加双蒸水至25μL。
8.3.2在各实时荧光PCR反应管中加入上述试剂后，盖紧管，离心55～10s。8.3.3将高心后的实时荧光PCR反应管放入实时荧光PCR检测系统内，记录样本摆放顺序。8.3.4实时荧光PCR反应条件随不同仪器略有改变，一般的反应程序为：95℃10s，1个循环：95℃5s，60℃30s，40个循环，在每次循环的退火时收集荧光。3
GB/T 21103—2007
8. 3. 5检测结束后,根据扩增曲线和(1 值判定结果。8.3.6检测过程中分别设阳性对照阴性对照和空白对照。用已知含哺乳动物源性成分的样品作阳性对照，用已知不含哺乳动物源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板刀N人作空白对照，
注：也可用等效的哺乳动物源性成分实时荧光 PCR 格测试剂盒进行实时荧光 ICR检测。9结果判断与表述
9.1结果分析条件设定
直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情说进行调整。9.2结果判定
9.2.1对照结果
空白对照：无 FAM荧光信号检出。有 HEX荧光信号检山,Ct值应35.0,阴性对照：无FAM荧光信号检出。有HEX荧光信号检山,Ct值应<.35.0：阳性对照:有 FAM和 HEX荧光信号检出。H FAM通道出现典型的扩增曲线,Ct 值,28. C。否则，实验视为无效，
9.2.2检测结果的判定
Ct值35为有效值,Ct值>35为无效值（详见表3）。表 3结果的判定猜流
FAM荧光
9.3结果表述
HEX荧光
检出哺乳动物源性成分：
未检出哺乳动物源性成分。
结果判定情况
同时进行的阴性、阳性，空白对照实验结果正常，检测实际样品时如果有FAM费光和HEX荧光检出，且 Ct值多35,判定为净有哺乳动物源性或分；如兴Ct值>35，可视为不含有哺乳动物源些或分。同时进行的阴性、阳性，空白对照实验结果正常，检测实际样品时，HEX荧光信号未检出,Cc值>85 (如果检测样品浓度高会抑制内参照 [3NA 的扩增);如某有FAM荧光检出,且 Ct值多35,判定为含有哺乳动物源性成分;如果 FAM 荧光Ct值>,可诱为不含有癌乳动物源性成分。同讨进行的创性、附性,空口对照实验结是正常,检测实际样昂时有 HEX荧光核山+无FAM荧光检出·判定为不含有哺乳动物源性成分。PCR反应失败。注以下儿个方面培再次进行反应。(D 如果同时进行的附注对照实验结果正常,则可能,足样品 DNA 制备有问题,如样品中可能存在 PCR反应的抑制物等，②如果间时进行的阳性对照实验结果不止带，则可能是实验操作失败或试剂失活。
检测过程中防止交叉污染的措施按照 SN/T 1198 执行。
废弃物处理
检测过程中的度弃物，收渠后在楚烧炉中焚烧处理。GB/T21703--2007
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