【国家标准(GB)】 动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法 PCR方法

ICS65.120
中华人民共和国国家标准
GB/T 21101—2007
动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法PCR方法
Identification of porcine derived materials in animal-originatedfeedstuffs--PCR mcthod
2007-10-24发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-04-01实施
本标推的附录A为资料性附录。
本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。KAoNiKAca
GD/T21101--2007
本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标推士要起草人：高宏伟、桑成珠、王岩、于立新、徐宝梁、陈颖、吴亚君、宗卉、温燕辉、曹际娟。本标推苔次发布。
1范围
动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法PCR方法
GB/T 211012007
本标准规定了动物源性饲料中括（Suidae）源性成分检测的PCR方法，该检测方法的检出限为0.1%.
本标准适用于动物源性饲料中猪源性成分的定性检测2规范性引用文件
下列文件中的条过本标准的引用而成的修改单（不包括勤误的内容）或修订版均不适）是否可使用这些
GB6682
GB/T146
SN/T119
术语和定义
下列术语
的最新版本
凡是不注日
标准的条部
凡是注日期的引用文件，其随后所有鼓励根据本标准达成协议的各方研究订本标准，然而，
的引用文件，其最新版本适用手本标准。验室用水规格和试验方法
饲料采样（GB/T
ISO6497:2002.IDT)
14699.12005
国检验实验室技术要求
文适用于本标准
聚合酶链式
用丁扩增位
DNA经过高温变
别与模板DNA两bzxZ.net
reaction,PCR
polymerase chaint
股己知序刻之间DNA（deoxyribonucleosideaacid，脱氧核糖核酸）的方法。模板成单链，在DNA聚合前和适宜的温度下，两条互不互补的寡核苷酸片段即引物分的一段五补序列发生遇
cxyribonucleaside tibe
和DNA合成这一循环，
循环，扩增倍数达到约
4原理
核苷酸
火·接着在DNA
聚合醇的催化下以4种uNTP(de-
为底物，使遇
引物得以伸，如此反复变性，退火于两段已知序列之问的DNA片段呈几何倍数增，经25个30个扩增利用裂解液破碎细胞，三氯甲烧抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物：PCR阳性产物应用限制性内切酶酶切反应进行确证。5试剂和材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB6682的要求。5.1猪源性成分检测用引物（对）序列为：POI F.5GCC TAA ATC TCC CCT CAA TGCTA-3*POIR.5'-ATGAAAGAGGCA AAT AGATTTTCG-35.2TagDNA聚合酶（Tag，Thermusuyuaticu，水生栖热菌）。5.3限制性内切酶，MnlI醇。
5.4dNTPs:dATP(deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺三磷酸）、dTTP(decxythymidinetriphosGB/T 21101—2007
KAONKAca
phate，脱氧胸背三磷酸），dCTP《dcoxycytidinetriphosphute，脱氧胞苔三磷酸），dGTP（deoxyguanosinetriphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）。5.5琼脂糖：电泳纯。
5.6化乙锭。
5.7 三氯甲烷。
5.8异丙醇，
5. 9 70%乙醇
5.10分子量标推品(100 bp ～2000 bp)(hp:hase pair,碱基对)。5.11裂解液：1%CTAB(cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三中基漠化铵）,0.05mol/L.TtisHCl(pH8.0)Tris -; tris (hydraxymethyl) aminomethane,三(羟甲基)氢基甲烷],0.7 mol/L NaCl,0.01 mol/LEDTA(pH8.0)(ethylene diaminetetraaretic acid,Z二胺四艺酸).5.12TE 缓冲液(Tris-IICI.EDTA 缓冲液>:10 mmol/L Tris-HCI （pII8. 0),1 mmol/I, FDTA(pH8. C).
5.1310×PCR绥冲液：100mtmol/LKCl160mmol/L(NH)SO，20mmol/LMgS0，200mmol/lTris-IICI（pH8.8),1%Triton X-100(t-octylphenoxypolyei.hoxyethanol,辛基苯氧基聚乙氧乙醇)，1mg/mLBSA(bovineserumaihumin，牛血清蛋白），5.14电泳缓冲液：xis54g，硼酸27.5g，0.5nol1/l.TE缓冲液pH8.0)20nL，加蒸缩水至1000mL使用时10倍稀释，
5.15漠化乙链忙存液：用水配制成1.0g/mL。5.16加样缓冲液：0.25%漠酚蓝，质量浓度为40%的能糖水溶液5. 17 酶切缓液:10 mmol/L Tis-HCl (pH7. 5),10 rnrnol/L MgCl,50 mmol/L NaCl,0. 1 mg/mL BSA。6仪器设备
6.1NA热循环仪。
6.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.3恒温水溶锅。
6.4离心机：离心力12000g。
6.5微量移液器：
6.6.电泳仪。
6.7 紫外检测仪。
6.8pH计。
6.9天：感量0.01g。
试样选取与制备
按照GB/T14699.1采样，将实验室样品粉碎，充分混合均匀后待用，8捡验步骤
8.1样品的总DNA提取
称取适量饲料（饲料粒度为100目称取50mz；60目称取100mg20自称取200mg）于1.5mL离心替中，加入600αL800μL裂解液，65.℃30mi，期间不时振荡混：12000g心5min；转移上清于洁净离心管中，加400μL三氯甲烷一异戊醇（24+1)，混勾；12000g离心5tmin，取上清液；加0.8倍体积异两醇，沉淀；12000g离心5min，弃上清液，70%乙醇洗涤一次，晾干，加入50uLTE，溶解沉淀也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA2
8.2JDNA度和纯度的测定
GB/T21101—2007
取5μI.DNA溶波加双蒸水稀释至1mI,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A2和Az8，1)NA的浓度按式（1)计算：c =- A X N X 50/1 000
式中：
c——DNA浓度，单位为微克每微升(μg/uL)：A—260nm处的吸光值；
N——核酸稀释倍数。
当A/A比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增。8.3PCR扩增
25μL的反应体系，在0.2mL的PCR反应管中，引物porF和porR各200nmnl/L,10×PCR反应缓冲液,2 rnmol/L MgCle，200 nmol/L dNTPs,1. 5 U Tag DNA聚合酶,1. 0 μL DNA模板(100 ng±50 ng DNA),
PCR反应条件随仪器不同略有改变，般的反应程序为：94℃预变性3nin。94℃变性45s.56℃退火45s，72℃延伸45s35个循环。72℃延伸5min。4℃保存检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含猪源性成分的样品作阳性对照，用已知不含猪源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DVA作牢白对照，8.4PCR扩增产物电泳检测
取2g谅脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入浪化乙锭延存液至终浓度为0.5g/mL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过胶。将5μI～8LPCR扩增产物分别和适量加样缓池液混合，点样。9V/cm恒压电泳，直至溪酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。紫外检测仪下观察电泳结果并记录。
8.5限制性内切酶酶切产电泳检测如果PCR扩增产物电泳检测结果阳性，进行限制性内切酶酶切反应。反应体系（20μL)，MntI酶2U，酶切缓冲液2μl加人PCR扩增产物至总体积20μL。酶切在37℃下进行，20mi。酶划完成后电泳，方法见8.4.9结果判断与表述
9.1PCR扩增产物电泳检测结果
阳性样品的PCR扩增产物大小为212bp(序列参考附崇A)9.2限制性内切酶酶切结果
阳性样品PCR产物采用内切酶MnlT酶切后，酶切片段大小为[96bp和16bp。9.3结果表述
PCR产物和酶切产物都为阳性者判为含有潴源性成分，表述为检出猪源性成分；PCR产物为阴性者判为不合有猪源性成分，表述为未检出猪源性成分。10检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193要求执行，
11废弃物处理
检测过程中的废齐物，收集后在梦烧炉中瑟烧处理。KAONKAca
GB/T21101—2007
附录A
（资料性附录）
PCR 产物测序结果
GCCIAAATCT CCCCTCAATG GTATGCCACA ACTAGATACA TCTACATGAT TCATTACAAITACATCAATA ATTATAACAT TATTTATTIT ATTCCAACTA AAAAICTCAA ACIACTCATACCCAGCAAGC CCAGAATCAA CCXGAACTCAA AACTCAAAAA CATAGCACCC CTTGAGAAATAAAATGAACG AAAATCTATT TGCCTCTTTCAT版权专有侵权必究
书号：155066：1-30289
GB/T 21101-2007
定价：
200-111
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