【国家标准(GB)】 动物源性饲料中马、驴源性成分定性检测方法 PCR方法

ICS 65. 120
中华人民共和国国家标准
GB/T 21107—2007
动物源性饲料中马、驴源性成分PCR方法
定性检测方法
Identification of horse and donkey derived materials in animal-originatedfeedstuffs-PCR method
2007-10-24发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-04-01实施
本标推的附录A为资料性附录
本标准由中华人民共和国国家质最监督检验检疫总局提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口，GB/T21107—2007
本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共利国育岛出人境检验检疫局，本标准主要起草人：宗卉、曾少灵、温燕辉、徐宝梁、高宏伟、陈颖、吴亚君、郑秋月、曹际娟。本标推首砍发布。
1范围
动物源性饲料中马、驴源性成分定性检测方法PCR方法
GB/T 21107—2007
本标准规定了动物源性饲料中马、驴（Equoidea）源性成分检测的PCR方法，该检测方法的检出限为0.1%（质量分数）。
本标准适用于动物源性饲料中马、驴源性成分的定性检测2
规范性引用文件
下列文件中的多
适本标准的引用而成
标准的条部
凡是主日期的引用文件，其随后所有鼓励根据本标准达成协议的各方研究活勤误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，的修改单（不包括
新版本适用于本标准。
凡是不注日期
的引用文件，其最
是否可使用这些
GB6582
GB/T146
SN/T119
术语和定义
下列术语
最新版本
规格和试验方法
验室用水
1O649712002DD
饲料采样（GBT
14699.1-2005
因检验实验室技术要求
文适用于本标准
polymerase chain
聚合酶链式反应
用于扩增位
DNA经过高温变
reaction,PCR
acid，脱氧核糖核酸）的方法：模板之间DNA
onncleaside
段已知序刻
deoxyri
主DNA聚合酶和适直的湿度下，两条互不互补的真核苷酸片段即引物分单链，在
别与模板 DNA两
段互补序列发生退火，接看在DNA聚冬酶的催化下以4种dNTP脱氧核苷酸
率酸）为底物退火引物得以延伸，如此反复变性、(deoxyribonucleosid@
使位于两段已知序列之间的DNA片段量几何赔数扩增，经25个～30个退火和DNA合成这
扩增循环，扩增倍数达到
利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物应用限制性内切酶酶切反应进行确证。5试剂和材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB6682的要求。马、驴源性成分检测用引物（对）序列为：5.1
5'tgccacagrtggatacatcaac 3
5'attgagattaggcgattgtt 3\
5.2TaqDNA聚合酶（Thermusuguaticu，水生栖热菌）。5.3限制性内切酶：Sau3A酶，AluI酵。5.4dNTPs:dATP(deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苔三磷酸），dTTP(deoxythymidinetriphosGB/T 21107—2007
phatc+脱氧胸苷三磷酸),dCTP(deoxycytidine triphosphate.脱氧胞苷三磷酸）.dGTP(deoxyguanosinetriphosphale，脱氧鸟苷三磷酸）。5.5 琼脂糖;电泳纯。
5.6溴化乙锭：
5.7 三氯甲烷,
5.8异丙醇。
5.970%乙醇。
5. 10分子量标准品(100 bp~2 000 hp)(bp:basc pair+碱基对)。5. 11 裂解液:1% CTAB(cetyltrithylatirnonium brornide, 六烷基=甲基溴化铵),0. 05 mal/L Tris-HCl(pH8. 0)[Tris-: tris (hydroxymethyl) aminomethane,三(羟甲基)氢基甲烷],0. 7 mol/L NaCl,0.01mol/LEDTA(pH8.0)(ethylenediaminetetraaccticacid，乙二胺四乙酸）。5. 12 TE 缓冲(Tris-HCI,EDTA 缓冲液): 10 mmol/L Tris-HCl (pH8. D),1 mmal/L EDTA(pH8. 0)。
5.1310xPCR缓冲液100mmol/LKCl.160mmol/L（NH)zSO，20mmo1/LMgSO..200mmol/LTris-HCl（pH8.8），1%TritonX-100（t-octylphenoxypolyethoxyethanol,辛基苯氧基聚乙氧乙醇），1rng/mLBSA(bovineserumalhumin，牛血清蛋白)：5. 14电泳缓冲被:Tris 54 g,硼酸 27.5 g,0. 5 mol/L TE缓冲液(pH8. 0)20 mL,加蒸水至 1 C00 mL;使用时10倍稀释。
5.15漠化乙锭贮存液：10mg/mL水游液。5.16加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（质量浓度）蔗糖。5. 17 萨切缓冲液:1) ntnol/L Tris-HCl (pH7. 5),10 mmol/L MgCl,50 titnol/L NaCl,0. 1 fng/tnL BSA,6仪器设备
6.1DNA热循环仪。Www.bzxZ.net
6.2离心机（离心力12000g）。
核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.3
微量移液器(0. 1 μL～2 μL,0. 5 μL-~10 μL,2 μL20 μL,10 μL--100 μL,20 μL-~200 μL,6.4
200 μL~1 000 μL).
6.5电泳仪。
紫外检测仪，
6.7 pH计.
恒温水浴锅。
天平(感量 0. 01 g)
试样选取与制备
按照GB/T11699.1采样，将实验室样品粉碎，充分混合均匀后待用。日检验步骤
8. 1样品的总 UNA 提取
称取适量饲料（饲料粒度为20目称取200mg.60目称取100mg,100目称取 50mg)于1.5mL离心管中，加人600μL～800L裂解液，65℃30min，期间不时振劳混匀；12000g离心5min转移上清于洁净离心管中,加 400 μL三氯甲烷一异戊醇(24+1),混勾,12 000g离心5 min,取上清液;加 0.8 倍体积异丙醇，沉淀;12 000g离心 5tmin,弃上清液;70%乙醇洗涤一次，晾干;人50 μL TE,溶解沉淀，2
也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。GB/T 21107—2007
8.2DNA浓度和纯度的测定
取5μLDNA落液，用ddHO(doubledistilledwater，双燕水）稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计检测260nm和280nm处的吸光值Ao和A。DNA的浓度按式（1)计算： - AXNX 50/1 000
式中：
-DNA浓度，单位为微觉每微升（μg/μL)；A——260nm处的吸光值：
N—核酸稀释倍数。
当A26/Azka比值为1.7~1.9之间时，适宜于PCR扩增。(1
8.3PCR扩增
50μL反应体系：10×PCR缓冲液5μLdNTPs(5mmol/L）1L引物对（5μmol/L）各2μL、TaqDNA合酶(5U/μL)0.5μL.模板DNA(100ng/50ngDNA)10μL.ddH.O8l.5μL反应条件：PCR反应条件随仪器不同略有改变，94℃预变性1minmin。94℃变性308~60s57℃退火308~~60$,72℃延伸30s~~60s,30个循环。72℃延伸5mim。4℃保存。检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含马或驴源性成分的样品作阳性对照：用已知不含马和驴源性成分的样品作阴性对照，用等体积的ddH2O代替模板DNA作空白对照。8.4PCR扩增产物电泳检测
取2.0g琼脂糖于100mL电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入淳化艺锭贮存藏至终浓度为0.5g/mL，制胶。在电泳槽中加人电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5μL~8μLPCR扩增产物分别和造量加样缀冲液混合·点。9V/cm恒压电泳，至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。紫外检测仪下观察电泳结果并记录。
8.5限制性内切酶酶切及产物电泳检测PCR扩增产物电泳检测结果阳性，进行限制性内切酶酶切反应。反应体系（50μL）：Sau3A酵1μL（10U/μL），酶切缓冲液5μ，PCR增产物20μL，ddIH024L。充分混勾反应液，37℃水浴1h，65℃水浴5min终止酶切反应，酶切完成后电涨，力法见8.49结果判断与表述
9.1PCR扩增产物电泳检测结果
马和驴源性成分的PCR扩增产物大小均为294bp(序列参考附录A)。9.2限制性内切酶切电泳检测结巢马源性成分的PCR扩增产物经Sau3A限制性内切酶酶切后，片段大小为226hp和68bp。驴源性成分的PCR扩增产物经ALu1限制性内切酶酶切后，片段大小为113bp和181bp。9.3结果表述
PCR扩增产物电泳检测结果阴性者判为不含有马、驴源性成分，表述为未检出马、驴源性成分，PCR扩增产物电泳检测结果阳性，限制性内切酶酶切产物片段大小正确，判为含有马或驴源性成分，表述为检出马或驴源性成分。10检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193执行。
11废弃物处理
检测过程中的废弃物，收架后在楚烧炉中樊烧处理。GB/T 211072007
附录A
（资料性附录）
PCR产物测序结果
马:TGCCACAGTT GGATACATCA ACATGATTTA TTAATATCGT CTCAATAATCCTAACTCTAT TTATTGTATT TCAACTAAAA ATCTCAAAGC ACTCCTATCCGACACACCCA GAACTAAAGA CAACCAAAAT AACAAAACAC TATGCCCCTTGAGAATCAAA ATGAACGAAA ATCTATTCGA ATCTTTCGCT ACCCCAACAATAGTAGGCCT CCCIATTGTA ATTCTGATCA TCATATTTCC CAGCATCCTATTCCCCTCAC CCAACCGACT AATCAACAAT CGCCTAATCT CAAT驴: TGCCACAGTT GGATACATCA ACATGATTTA TTAATATCGT CTCAATAAFCCTAACTCTAT TTATTGTATT CCAACTAAAA ATTTCAAAGC ACTCTTATCCAATACACCCA GAAGCTAAAA CAACTAAAAT AGCTAAACGC CTTACCCCTTGAGAATCAAA ATGAACGAAA ATCTATTCGC CTCTTTCGCT ACCCCAACAATAATAGGCCT CCCTATTGTAATCCTAATCA TTATATICCC CAGCATCCTATTTCCCTCAT CCAACCGACT AATTAACAAT CGCCTAATCT CAAT版权专有侵权必究
书号：155056：1-30295
GB/T 21107-2007
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