【商检行业标准(SN)】 乳及乳制品中I结核分枝杆菌检测方法 荧光定量PCR法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2101—2008
浮乳及乳制品中结核分枝杆菌检测方法荧光定量PCR法
Determination of Mycobacterium tuberculosis for milk and milk products-Real-timePCRmethod
2008-07-17发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2009-02-01实施
本标准附录A为规范性附录
本标准出国家认证认可监督管理委员会提出并归口本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局本标准主要起草人：吴斌、胡传伟、贾藝、李叶、李振荣、孙颖杰。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。http://foodmate.netSN/T2101—2008
本标准附录A为规范性附录。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局，本标准主要起草人：吴斌、胡传伟、贾、李叶、李振荣、孙颖杰本标准系首次发布的检验检疫行业标准SN/T2101-2008
1范围
乳及乳制品中结核分枝杆菌检测方法荧光定量PCR法
SN/T 2101—2008
本标准规定了乳及乳制品中牛型结核分枝杆菌和人型结核分枝杆菌荧光PCR检测的操作方法。本标准适用于鲜乳，乳粉中结核分枝杆菌的检测，其他乳制品可参照执行2原理
乳及乳制品中结核分枝杆菌荧光PCR检测方法是采用经典的TaqMan探针技术。根据牛型和人型结核分枝杆菌的保守序列设计一对特异性引物及一条特异性荧光双标记探针，探针的5端和3'端分别用 FAM 和 TAMRA荧光素标记。当PCR反应退火时,引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上报告荧光基团FAM发出的荧光信号被淬灭荧光基团TAMRA所吸收，仪器检测不到FAM基团所发出的荧光信号；当PCR反应进行延伸时，Tag酶在引物的引导下，以四种核苷酸为底物，根据碱基配对的原则，沿着模板链合成新链，当进行到探针结合部位时，受到探针的阻碍而无法继续，此时的Taq酶发挥它的5→3外切核酸酶的功能，将探针切成单核苷酸以便继续完成延伸过程，而FAM基团和TAMRA基团均游离于溶液中，仪器可检测到FAM基团所发出的荧光信号。3缩略语
下列缩略语适用于本标准。
荧光PCR
荧光聚合酶链反应。
每个反应管内的荧光信号达到设定的阐值时所经历的循环数3.3
脱氧核糖核酸。
Taq酶
Taq DNA 聚合酶。
4材料与试剂
4.1仪器与器材
4. 1. 1 荧光 PCR 检测仪。
4.1.2高速台式冷冻离心机。
4.1.3普通台式离心机。
4. 1.4涡旋振荡器。
4. 1.5 冰箱:4℃±1℃,—20℃±2℃。合品伙伴网h
SN/T 2101—2008
4.1.6微量可调移液器及配套带滤芯吸头。4. 1.7 1.5 mL. Eppendorf 管。4. 1. 8 10 mL离心管。
4.1.9一次性手套。
4.1.10紫外灯。
4.1.11生物安全柜。
4.2试剂
除特别说明以外，所用试剂均为分析纯，实验用水为双蒸水。4. 2. 1 4%氢氧化钠:见第 A. 1章。4.2.20.9%灭菌生理盐水见第A.2章，4.2.320mg/mL蛋白酶K：见第A.3章。4.2.410%SDS:见第A.4章。
4.2.5pH5.23mol/L醋酸钠：见第A.5章。4.2.6pH8.0TE缓冲液：见第A.6章。4.2.7，结核分枝杆菌卡介苗阳性样本：由中国兽医微生物菌种保藏管理中心提供。4.3抽样、采样工具
采样工具（棉拭子、剪刀、镊子、注射器、离心管、研钵）应经121℃士2℃,15min高压灭菌并烘干。4. 4检测引物和探针见表 1。
表1荧光定量PCR检测引物和探针引物和探针序列
正义引物P1：5'-GGTCGACACATAGGTGAGGTCT-3反义引物P2.5-CGCTGATCCGGCCAC-3探针：5'-FAM-CCGAAGCGGCGCTGGACGAG-TEMRA-3'5操作方法
5.1样品采集
5.1.1鲜乳的采集
用无菌注射器直接吸取5mL至10mL离心管中，编号备用。5.1.2乳粉的采集
无菌操作取25g样品，放入无菌袋中，编号备用，5.2样品购运
扩增片段大小/bp
样品采集后，4℃保存应不超过24h，若需长期保存应置一20℃以下，但应避免反复冻融，或放于加入冰块的保温箱中，密封后直接送实验室检测。5.3样品制备
5.3.1鲜乳
样品在混勾器上充分混合后，经4000r/min离心40min，弃上清液，加人5mL生理盐水重悬沉淀，定性滤纸过滤，滤液经4000r/min离心40min，弃上清液，加人500μL生理盐水重悬沉淀，编号备用。
5.3.2乳粉
无菌操作取待检样品5.0g放入灭菌烧杯中，加50mL生理盐水，剧烈振荡混匀，4000r/min离心40min，弃上清液，加人10mL生理盐水重悬沉淀，定性滤纸过滤，滤液4000r/min离心40min，弃上清液，加人500μL生理盐水重悬沉淀，编号备用。2
ht
5.4DNA提取
SN/T 2101-2008
5.4.1在样品中加人1.5mL4%的氢氧化钠溶液，37℃恒温处理30min或常温下1h，使其充分液化：若液化不完全，可适当再加人少量4%的氢氧化钠。5.4.2将液化后的样本500μL以及试剂盒中的阴性对照、阳性对照各500μL分别加人1.5mL无菌离心管中，13000r/min离心10min。5.4.3弃上清液，用微量移液器尽量吸干液滴，沉淀中加人1mL灭菌生理盐水，振荡悬浮，13000r/min离心10min。
5.4.4 弃上清液,加人1mL灭菌生理盐水,13 000 r/min离心10 min。5.4.5弃上清液,用0.5mL灭菌生理盐水重新悬浮沉淀，加12.5μL20mg/mL的蛋白酶K和50μL的10%的SDS,55℃水浴作用30min。5.4.6分别用Tris饱和酚、等体积酚：三氯甲烷和三氯甲烷各抽提一次。5.4.7吸取上层水相，加1/10体积的pH5.23mo1/L醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀2h,4℃13000r/min离心10min。
5.4.8弃上清液，加入75%的乙醇，4℃13000r/min离心10min。5.4.9弃上清液，晾干，加20μLTE缓冲液溶解，直接用于检测或一20℃保存备用。注：可以采用等效商品化DNA提取试剂盒进行操作。5.5样本的检测
5.5.1扩增试剂准备
在反应混合物配制区进行。从试剂盒中取出相应的荧光PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2000r/min离心5s。设n为被检样品总数，反应体系配制见表2.并将总样品反应组分涡旋，充分混勾，向每个荧光PCR管中各分装15μL，转移至样本处理区。表2反应体系配制
PCR反应体系中各成分
10XPCR buffer(Mg+free)
MgSO, (25 mmol/L)
dNTP(2. 5 mmol/L)
正义引物（10μmol/L）
反义引物(10 μmol/L)
Probe(5 μmol/L)
Taq酶
5.5.2加样
每个样品反应组分用量/μL
总样品反应组分用量/μL
2.5×(n+2)
0.5×(n+2)
2.0x(n+2)
0.5x(n+2)
0.5x(n+2)
0.5×(n+2)
7.0x(n+2)bzxZ.net
0.5X(n+2)
在样本处理区进行。在各设定的荧光PCR管中分别加入5.4.9中制备的DNA溶液各10μL，盖紧管盖，500r/min离心30s。
5.5.3荧光PCR检测
5.5.3.1循环条件设置
荧光PCR检测仪时循环程序为：94℃1min；95℃，5s,60℃30s,40个循环。注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整5.5.3.2仪器检测通道选择
单通道荧光PCR检测仪，无需选择检测通道；多荧光检测仪，荧光信号收集时设定为FAM荧光素，60℃收集荧光信号。
合品件
SN/T 2101-2008
5.6结果判定
5.6.1结果分析条件设定
直接读取检测结果。阅值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阅值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
5.6.2质控标准
5.6.2.1阴性对照无Ct值并且无荧光增幅现象。5.6.2.2阳性对照的Ct值应小于28.0，并出现典型的扩增曲线。5.6.2.3阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件则试验视为无效。5.6.3结果描述及判定
5.6.3. 1阴性
无Ct值或无荧光增幅现象
5.6.3.2阳性
Ct值小于等于30，且出现荧光增幅现象表示样品中存在结核分枝杆菌。Ct值小于等于30，但无荧光增幅现象为可疑，重做，仍未出现炭光增幅现象为阴性。S
香品伙件
A.14%氢氧化钠
附录A
（规范性附录）
SN/T 2101-2008
取80mL去离子水置于100mL~200mL塑料烧杯中，称取4g氢氧化钠逐渐加人到烧杯中，边加边搅拌，完全溶解之后，定容至100mL。将溶液转移至塑料容器中，室温保存。A.20.9%灭菌生理盐水
取9g氯化钠，加入800mL去离子水，完全溶解后，定容至1L，121℃15min灭菌后，室温保存。A.320mg/mL蛋白酶K
取200mg的蛋白酶K加人到9.5mL水中，轻轻摇动至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10mL，然后分装成小份一20℃保存。A. 4 10% SDS
取10gSDS置于100mL~200mL烧杯中，加入80mL的去离子水，68℃加热溶解，用浓盐酸调节 pH值至7. 2。定容至100 mmol/L后,室温保存。A.5pH5.23mol/L醋酸钠
取40.8g醋酸钠（NaOAC3H,O)置于100mL~200mL烧杯中，加人约40ml去离子水搅拌溶解，加入冰醋酸调节pH值至5.2.定容至100mL。121℃15min灭菌后，室温保存。A,6 pH8.0 TE缓冲液
A. 6. 11 mol/L Tris-HCI(pH8. 0)溶液取121.1gTris置于1L烧杯中，加人800mL去离子水，充分搅拌溶解，冷却至室温后，用浓盐酸调pH值至8.0，定容至1L,121℃15min灭菌后，室温保存。A.6.2500mmol/LEDTA(pH8.0)溶液取186.1gNa,EDTA·2H.O置于1L烧杯中，加人800mL去离子水，充分搅拌溶解，用氢氧化钠调pH值至8.0,定容至1L,121℃15min灭菌后，室温保存。A.6.310×TEBuffer
取 1 mol/L Tris-HCl(pH8. 0)溶液 100 mL 和 500 mmol/L EDTA(pH8. 0)溶液 20 mL 置于 1 L烧杯中，加人800ml去离子水，均匀混合，定容至1L后，121℃15min灭菌后，室温保存。使用时工作液浓度为1×。
食品伙售
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