【商检行业标准(SN)】 食源性原体PCR检测技术规范 第3部分：定性检测方法样品制备要求

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2102.3—2008/IS020837:2006食源性病原体PCR检测技术规范
第3部分：定性检测方法样品制备要求Polymerasechainreaction(PCR)for thedetection of food-borne pathogensPart 3:Requirements for sample preparation for qualitative detectionISO20837.2006.Microbiologyof foodandanimalfeeding stuffsPolymerase chain reaction(PCR)for the detection of food-borne pathogensRequirements for sample preparation for qualitative detection,IDT2008-07-17发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2009-02-01实施
SN/T2102.3—2008/ISO20837:2006SN/T2102《食源性病原体PCR检测技术规范》共分为四个部分：第1部分：通用要求和定义；
一第2部分：PCR仪性能试验要求；一一第3部分：定性检测方法样品制备要求；一第4部分：定性检测方法扩增和检测要求。本部分为SN/T2102的第3部分
本部分等同采用ISO20837:2006《食品与动物饲料微生物学食源性病原体PCR检测定性检测方法样品制备要求》，并做了如下编辑性修改：对“前言”和“引言”进行了修改；一对“规范性引用文件”的描述按照GB/T1.1的要求进行了修改；一将标准中的国际标准用相应的国家标准或行业标准替代，如：SN/T2102.1代替ISO20863；一将附录B.4.1中的试剂浓度改写为适用于中文的表达方式；一将“警告“改为“安全要求”，并放置到标准的未尾段；一在表A.1中加人了相应的国家标准；删除了文后的参考文献部分。
本部分的附录A和附录B为资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分由中华人民共和国内蒙古出人境检验检疫局、中华人民共和国山西出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局负责起草。本部分主要起草人：王海艳、李卫华、高旗利、黄晓蓉、姚霞、刘宏、赵林立。本部分系首次发布的出入镜检验检疫行业标准。SN/T2102.3—2008/IS020837:2006引言
使用PCR技术检测食源性病原体常包括以下步骤：-样品的均质；
一增菌和样品处理；
一核酸的提取；
目标核酸扩增；
扩增产物检测。
ISO20837：2006由欧洲标准委员会（CEN）食品分析水平方法技术委员会（CEN/TC275）与食物产品技术委员会（ISO/TC34)微生物小组委员会（SC9）依照ISO和CEN技术合作协议联合制定，本部分等同采用ISO20837：2006.为《食源性病原体PCR检测技术规范》的第3部分，规定了以获得质和量均适合定性PCR检测的样品或核酸为目的的样品制备要求。附录A列出了食品样品中细菌增菌的标准方法。附录B通过实例介绍了特定样品的制备过程1范围
SN/T2102.3—2008/ISO20837:2006食源性病原体PCR检测技术规范
第3部分：定性检测方法样品制备要求SN/T2102的本部分规定了PCR样品制备的要求，用以获得质和量均适合定性PCR检测的样品或核酸。
本部分适用于食品中病原体的PCR检测，必要时也可用于饲料、农产品/环境样品的PCR检测。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过SN/T2102的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
SN/T2102.1一2008食源性病原体PCR检测技术规范第1部分：通用要求和定义3原则
3.1概要
样品制备方法的目的是获得质和量均适合PCR检测的样品或核酸。核酸的质量取决于所提取核酸的化学纯度、分子平均长度以及结构完整性。增菌和样品处理结果应以检测到少量的目标微生物并减少PCR抑制物质为目的。采用对核酸完整性破坏程度最低的物理、化学或生化操作，以获得适合PCR扩增的样品或核酸溶液。
3.2增菌和样品处理
可以对不经增菌培养的样品直接进行样品处理，也可以根据附录A中所列标准或其他适宜标准在对样品进行增菌培养后再进行处理。3.3核酸提取
核酸提取的基本原理包括释放细菌中的DNA以及同时或随后去除PCR抑制物质。附录B中给出了一种DNA提取/纯化方法的示例。本方法仅作为示例，使用者可以进一步改进以满足不同实验室的需要。
4通用实验室要求
应按照SN/T2102.1一2008中6.3的规定，在独立工作区或工作间内对样品进行处理。5试剂、仪器和设备
参见本标准附录A和附录B及SN/T2102.1。6操作程序
6.1细菌的增菌和样品处理
6.1.1增菌
应按照适宜标准中推荐的培养基对食品样品进行增菌培养。也可以使用其他更适合的增菌培养SN/T2102.3—2008/IS020837:2006基，但这些培养基的增菌效果至少不应低于表A.1国际/国家标准中培养基的增菌效果。推荐使用表A.1中国际标准中的增菌培养基，这些培养基中含有较少的PCR抑制物。当无法获得国际标准时，也可使用表A，1国家标准中的培养基或其他类似产品，但应尽量避免使用抑制剂含量高的增菌培养基。对于特殊产品，应注意抑制竞争性背景微生物的生长（如：加人选择性化学物质或抗生素）。6.1.2细菌的处理
可以尝试采用最低破坏程度的方法，如简单的稀释、离心、蛋白消化、过滤、密度离心、免疫磁性分离等。如上述方法无法提取到细菌DNA，可使用煮沸、加人螯合剂或烈性化学试剂（如：三氯甲烷和乙醇）等更为剧烈的方法或使用相应的试剂盒提取。可使用简单的物理方法降低高脂样品中的脂肪成分。可使用整合剂降低奶制品中有抑制作用的高钙成分6.2核酸提取
6.2.1DNA提取
6.2.1.1DNA的释放和纯化
可以将几个DNA提取原理结合起来使用。例如，可以采用下列步骤进行提取：用蛋白酶（如：蛋白酶K)降解细胞提取物中的蛋白质，用核糖核酸酶降解RNA：a）
b）用有机溶剂（如：苯酚和三氯甲烷混合物）沉淀所产生的肽类物质，将DNA留在水相；在单价阳离子存在的情况下，用乙醇进一步浓缩纯化DNA溶液；d）通过离心收集沉淀的DNA；
e）DNA经乙醇清洗后，重新悬于缓冲液中（如：Tris-EDTA缓冲液或Tris缓冲液）。为了提高DNA的回收率，在沉淀步骤中可以使用肝糖原、聚乙二醇（PEG）或转运RNA（t-RNA）等DNA协同沉淀物。只有不含任何核酸酶活性、PCR抑制/竞争物质以及任何与被检PCR目标片段同源序列物的DNA协同沉淀物才可以用于PCR注：使用真空冷冻干燥器对沉淀后获得的DNA沉淀物进行干燥可能造成交叉污染。可使用细胞热处理方法（如：煮沸10min）释放DNA。将样品煮沸后，冷却、离心，取上清液用于PCR。煮沸前进行酶处理（如：溶菌酶、变溶菌素可用于革兰氏阳性菌），再加入蛋白酶进行温育消化，可促进细胞裂解。对于具有坚韧细胞壁的细菌（如：分枝杆菌属的细菌），需要使用其他方法，如加人磁珠刮烈摇动。包括试剂盒在内的其他方法，当其核酸提取效果不亚于上述方法时，也可以用于核酸提取6.2.1.2DNA的质和量
a）：当检测物中存在足够数量的DNA时，采用指定方法从指定检测物中提取的用于PCR反应的DNA的质和量应具有重复性和再现性。所用方法提取的DNA片段的平均长度应该大于或等于被测PCR产物；
b）可通过荧光法或凝胶电泳法评估提取DNA的浓度和纯度。分光光度法可对纯化的DNA进行定量；
琼脂糖凝胶电泳并经漠化乙锭染色后根据紫外灯下凝胶中的荧光能快速评估DNA质和量；c）
d）煮沸等核酸制备方法得到的核酸不稳定，制备后应立即使用；应避免对核酸溶液反复冻融；
f）应使用适宜的塑料器血储存低拷贝的核酸。注：一些试管材料可能吸附核酸6.3质控对照
应依据SN/T2102.1—2008中9.3和表1的规定使用质控对照。7安全要求
本部分在使用过程中可能接触到试剂、操作和仪器所带来的危害，文中不再对其使用过程中的所有安全问题进行陈述，使用者最好建立安全和健康规定，并在使用本部分前确定适当的安全限制2
沙门氏菌（Salmonellaspp.）
寸录A
（资料性附录）
SN/T2102.3-—2008/ISO20837:2006与微生物（细菌)增菌有关的标准表A.1
金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）蜡样芽胞杆菌（Bacilluscereus）产气英膜梭菌（Clostridiumperfringens）弯曲杆菌属（Campylobacterspp.）小肠结肠炎耶尔森氏菌
(Yersinia enterocolitica)
单核细胞增生李斯特氏菌
(Listeria monocytogenes)
大肠杆菌O157(EscherichiacoliO157)志贺氏菌属（Shigellaspp.）bzxZ.net
些微生物（细菌）的专用标准
国际标准/国家标准
ISO 6579/GB/T 4789. 4
ISO6888-3/GB/T4789.10
ISO7932/GB/T4789.14
ISO7937/GB/T4789.13
ISO10272-1/GB/T4789.9
ISO10273/GB/T 4789.8
ISO11290-1/GB/T4789.30
ISO16654/GB/T 4789.6
ISO21567/GB/T4789.5
SN/T2102.3—2008/ISO20837:2006附录B
（资料性附录）
革兰氏阴性细菌DNA提取方法
B.1适用性
本方法适用于用裂解或煮沸方法从革兰氏阴性菌中提取DNAB.2概况
本方法已得到了广泛应用，并在检测奶粉中的沙门氏菌和碎肉中产Vero细胞毒素大肠杆菌（VTEC)进行的实验室间的协同研究实验中证明了方法的有效性。B.3原理
方法步骤包括：离心获得细菌细胞。将细菌细胞洗涤后于95℃100℃裂解，离心使细胞壁碎片、多聚糖和蛋白质沉淀，获得核酸提取物。通常要先用增菌肉汤对细菌进行增菌。B.4试剂
B.4.1洗涤缓冲液
生理盐水溶液（NaCI9g/L）或磷酸盐缓冲液（PBS）（NaCl8g/L，KCI0.2g/L，Na2HPO1.44 g/L,KH2PO40.24 g/L.pH7.4)B.5仪器设备
除常规实验室设备，还应具备以下特殊仪器设备。B.5.1微量移液器
B.5.2台式离心机
配有可容纳1.5mL～2mL微量反应管的转子，加速度可调至10000g。B.5.3水浴或加热块
适用于微量反应管，能够加热到100℃。B.5.4振荡器
可使用涡旋混匀器及类似仪器。B.6操作步骤
B.6.1概要
增菌之后，按照B.6.2所述方法提取细菌DNA。B.6.2提取步骤
取1mL细菌增菌肉汤加人反应管，于10000g离心10min(B.5.2)弃去上清液；a）
b）将沉淀物重新悬于1mL洗涤缓冲液（B.4.1)或水中，再于10000g离心10min(B.5.2），弃去上清液；
用200μL～250μL水重新悬沉淀物。于95℃、20min（沙门氏菌）或100℃、15min（产志贺氏毒素大肠杆菌，STEC)对细菌细胞进行热消化；d）将反应管移至冰浴中使其迅速冷却；用力混合裂解物[如：使用振荡器（B.5.4）]。在20℃~25℃条件下，于10000g离心3mine
（沙门氏菌）或10000g离心10s（STEC）；f）将上清液移人新的微量反应管。SN/T2102.3-—2008/IS020837：2006当对照实验表明核酸提取物中存在PCR抑制物质，应在用于PCR反应之前对其进行纯化。也可以选用市售的核酸提取纯化试剂盒并按试剂盒使用说明书进行操作，以此替代热处理和纯化步骤。B.7方法确认
本方法已经得到广泛应用，是分子生物学的基本方法。而且本方法已经在协同实验中得到了确认。1998年，德国标准化机构（DIN）“食源性微生物PCR检测”工作组组织了一次实验室间比对测试。12个实验室参与了测试，每个实验室收到20个样品，样品材料为低脂奶粉。对部分奶粉样品人工接种了1000cfu/25g的沙门氏菌。在提取DNA前，实验室对样品进行了以下处理：将25g样品加人到250mL非选择性增菌液中（0.002%黄绿），37℃培养16h。取1mL该增菌液进行核酸提取。用PCR方法对提取核酸进行检测。总共分析了240个样品，发现1个样品为假阴性，2个样品为假阳性；14个样品存在PCR抑制情况。2001年，德国联邦消费者保护和兽医卫生学会（BgVV）“食源性微生物的PCR检测”工作组遵照德国联邦食品法第35条的规定组织了一次协同研究，对本方法进行了确认。11个实验室参与了研究。每个实验室均收到了由两种基质制备的10份碎肉样品。在每个实验室的样品中，有5份样品接种了已知的STEC/EHEC菌株，接种量为54cfu/25g～308cfu/25g碎肉。其他杂菌数量在10°cfu/g～10cfu/g之间，有时更高一些（由于运输的缘故）。样品1～9由同一种基质制备，另外4个样品自然带有STEC菌株。所有实验室对这些样品的检出率均为100%。SN/T2102.3—2008/IS020837:2006Preface
Polymerase chain reaction(PCR)for the detection of food-borne pathogens are series standardsincluding4partslistasfollows：Part 1:General requirements and definitionsPart 2:Performance testing for thermal cyclers;Part 3:Requirements for sample preparation for qualitative detection;Part4:RequirementsforamplificationanddetectionforqualitativemethodsThisStandard isthethirdpartoftheseseriesstandardThe consistencydegreeof this standard and IsO20837:2006 is identification,the main showing bel-lows：
ModifyForewordDeleteIntroductionof originalstandardModify\Normativereferences\accordingtotheGB/T1.1;Substitute the International standard with National standard or SN standard.Forexample substituteSN/T2102withISO20863
Modify the expressivemodeof reagent in B.4.1to Chinesemode;Add corresponding national standard in table A. 1;SubstituteWARNINGwithSafetyprecaution,andputitattheendofthispartDelete the reference documentation behind the test of this standard.Thisstandardswasproposed andadministrated byNationalRegulatoryCommissionforCertificationandAccreditation.
AnnexAandAnnexBisinformative.This standards was proposed and administrated by National Regulatory Commission for CertificationandAccreditation.
SN/T2102.3—2008/IS020837:2006This standards was drafted by Inner Mongolia Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,ShanXiEntry-Exit Inspectionand Quarantine BureauTianJin Entry-Exit Inspectionand Quarantine Bureau.Fu-JianEntry-ExitInspectionandQuarantineBureauMain drafters of this standard are Wang Haiyan,Li Weihua,Gao Qili,Huang Xiaorong,YaoXia,Liuhong,Zhao linli.
This standard is a professional standard of entry-exit inspection and quarantine promulgated for thefirst time.
Note: This English version,a translation from the Chinese text,is solely for guidanceSN/T2102.3—2008/ISO20837:2006Foreword
Thedetection of food-bornepathogensbyPCR is usuallyperformed bymeans of the followingsuccessive(orsimultaneous)steps：homogenizationofthesample;
(cultural)enrichmentof thepathogen under studyandsampletreatment;nucleicacidextraction(optional);amplificationofnucleicacidsfromthepathogenunderstudydetectionoftheamplifiedDNAfromthepathogenunderstudyIS020837:2006 was prepared by the European Committeefor Standardization（CEN)TechnicalCommitteeCEN/TC275,Foodanalysis-Horizontal methods,incollaborationwithTechnicalCommit-teeIsO/TC34,Foodproducts.SubcommitteeSC9,Microbiology.inaccordancewiththeAgreementontechnicalcooperationbetweenISOandCEN(ViennaAgreement).The consistency degree of this part and isO 20837:2006 is identification,is the third part of thestandard:\Polymerase chain reaction(PCR)for the detection of food-borne pathogens\.It gives therequirements for sample preparation for the qualitative detection of food-borne pathogens using thepolymerasechainreaction(PCR)inordertoobtainPCR compatible samples ornucleicacidsof suitablequalityandquantityforPcR.Concerningenrichmentof bacteria fromfoodmatricesaregiven inAn-nexA.Anexampleof a specific methodforsamplepreparation isgiven inAnnexB.oo
1Scope
SN/T2102.3—2008/IS020837:2006Polymerase chain reaction(PCR)for thedetection of food-borne pathogensPart3:Requirementsforsamplepreparationforqualitativedetection
Thispart provides criteria for samplepreparation inorder to obtainPCRcompatible samples ornucleicacidsofsuitablequalityandquantityforPcR.This Standard has been established for food matrices,but could also be applied to feed and agricultural/environmentalmatriceswithsomeadaptations.ifnecessary2 Normative references
Thispart of SN/T 2102 incorporates by dated or undated reference.provisions from other publica-tions.These normative references are cited at the appropriate places in the text and the publicationsare listed hereafter.For dated references subsequent amendments to or revisions of any of thesepublications apply to this part only when incorporated in it by amendment or revision.For undatedreferences the latest edition of the publication referred to applies(including amendments).SN/T2102.1—2008Polymerasechainreaction(PCR)forthedetectionoffood-bornepathogensPart 1:General requirements and definitions3Principle
3.1General
The objective of the samplepreparation methods described is to obtain samples or nucleic acids ofsuitable quality and quantity for PCR. The quality of nucleic acids depends for example on thechemical purity,the average length of the molecules and the structural integrity of the extractednucleic acid molecules.Enrichment and sample treatment should allow the detection of low numbersof target microorganisms and the reduction of PCR inhibitory substances.Physical,chemical orbiochemical procedures,least destructive to the nucleic acid integrity,should renderthe sample orthenucleicacidsolutioncompatiblewithPcRamplification.3.2Enrichmentand sample treatmentSample treatment may start directly from the sample or after enrichment as described in the stand-
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