【商检行业标准(SN)】 食源性原体PCR检测技术规范 第2部分：PCR仪性能试验要求

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2102.2—2008/IS0/TS20836:2005食源性病原体PCR检测技术规范
第2部分：PCR仪性能试验要求
Polymerase chain reaction(PCR)for the detection of food-bornepathogens-Part 2:Performance testing for thermal cyclers[ISO/TS 20836:2005,Microbiology of food and animal feeding stuffs-Polymerase chain reaction(PCR)for the detection of food-borne pathogensPerformance testing for thermal cyclers,IDT2008-07-17发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2009-02-01实施
SN/T2102.22008/ISO/TS20836:2005SN/T2102：《食源性病原体PCR检测技术规范》共分为四个部分：—一第1部分：通用要求和定义；一第2部分：PCR仪性能试验要求；——第3部分：定性检测方法样品制备要求；一第4部分：定性检测方法PCR扩增要求。本部分为SN/T2102的第2部分。
本部分等同采用ISO/TS20836：2005《食品与动物饲料微生物学食源性病原体PCR检测PCR
仪性能试验要求》，并做了如下编辑性修改：对“前言”和“引言”进行了修改；一对“规范性引用文件”的描述按照GB/T1.1的要求进行了修改；一将标准中的国际标准用相应的国家标准或行业标准替代，如：GB/T27025代替ISO17025；一将第A，3章中试剂浓度的表述方式改为中文表述方式；一将“警告”改为“安全要求，并放置到标准的末尾段；删除了标准后的参考文献。
本部分的附录A和附录B均为资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分由中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山西出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局负责起草。本部分主要起草人：李卫华、赵贵明、李晓虹、王振国、许龙岩、雷质文、邹明强、刘守贤。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。I
SN/T2102.2—2008/IS0/TS20836:2005引言
聚合酶链式反应（PCR)具有快速、灵敏和特异的优点，利用PCR技术进行食源性微生物的检测方法近年来发展十分迅速。
目前，PCR仪在技术方面已十分完善，但因受珀耳帖效应及制作工艺的影响，加热、冷却元器件具有一定的使用寿命，这些元器件的正常功能取决于其本身质量以及正确的使用与维护。为此，进行PCR仪的日常维护仍十分必要
ISO/TS20836：2005，由欧洲标准委员会（CEN）食品分析水平方法技术委员会（CEN/TC275）与食物产品技术委员会（ISO/TC34）微生物小组委员会（SC9）依照ISO和CEN技术合作协议联合制定。
本部分等同采用ISO/TS20836：2005，为《食源性病原体PCR检测技术规范》的第2部分。规定了PCR仪（包括制冷/加热元件）安装、使用与维护的一般原则。资料性附录A和附录B中规定了PCR仪性能试验的生化和物理方法。
1范围
SN/T2102.22008/ISO/TS20836:2005食源性病原体PCR检测技术规范
第2部分：PCR仪性能试验要求
SN/T2102的本部分确立了PCR仪的安装、使用、维护的基本要求，规定了PCR仪性能试验的生化和物理方法。PCR仪的制冷/加热元件都有规定的使用寿命，其正常功能的发挥不仅取决于设计的质量，也取决于正确的使用和维护。本部分适用于PCR仪的生化和物理性能试验。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过SN/T2102的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T27025检测和校准实验室能力的通用要求SN/T2102.1食源性病原体PCR检测技术规范第1部分：通用要求和定义3术语和定义
SN/T2102.1确立的以及下列术语和定义适用于SN/T2102的本部分。3.1
热盖 heat lid
PCR仪上防止反应管中反应液蒸发的装置。3.2
温度均匀性
temperatureuniformity
温控装置（如加热模块中)内温度的均匀性。3.3
生物化学性能试验biochemicalperformancetest通过生物化学方法（如温度敏感PCR反应）测定PCR仪性能的试验程序。3.4
物理性能试验physicalperformancetest通过物理方法测定PCR仪性能的试验程序。3.5
非精确PCR体系non-robustPCRsystem因偏离预定的PCR化学或温度控制程序而导致扩增效果减弱的PCR体系。3.6
临界位置criticalposition
PCR仪多孔反应板中样品的实际温度与显示温度易发生偏离的位置或区域，4PCR仪的安装
按照生产商说明书中的要求进行安装应在适宜的温度（5℃～40℃）和湿度（相对湿度≤80%）环境SN/T2102.2—2008/IS0/TS20836:2005中安装和运行PCR仪。并应将PCR仪放置在符合以下条件的位置：一便于检查；
一便于PCR仪与环境之间稳定的热交换和空气流通；一稳定的环境。
5PCR仪的维护
实验室应根据每台PCR仪的使用时间和运行次数建立和实施特定的维护程序。6性能试验
6.1概述
利用间接的生化方法或直接的物理方法对PCR仪的性能进行试验并记录。6.2生化试验法
应使用对温度敏感的PCR反应对PCR仪进行生化性能试验。附录A为生化试验的实例，其他满足要求的PCR方法均可使用。应根据仪器的使用时间和运行次数确定每台PCR仪的试验频率。6.3物理试验法
物理试验法是测量PCR仪每个样品反应孔在热循环过程中的实际温度并与显示温度进行对比的方法。附录B为物理试验的实例。当PCR仪无法进行生化试验或生化试验显示无扩增效果时，应进行物理试验，并根据使用时间和运行次数确定每台PCR仪的试验频率。7试验报告和非正常情况的记录
实验室应建立文件控制程序，用来确认和描述PCR仪的异常情况（详见GB/T15481）。试验报告应符合GB/T27025的要求，且至少应包括以下内容：一被试验PCR仪的编号；
一用于试验的方法；
试验日期；
—试验分析负责人；
一试验结果；
一试验过程中观察到的具体细节；所有与试验标准偏离的情况；
一其他与试验有关的信息。
安全要求
本部分未列出使用中涉及到的所有安全问题。操作者在使用本部分时可能受到由有害物质、仪器设备和操作不当所造成的危害，实验室管理者应预先建立适宜的安全健康规定，以避免危害的发生2
A.1概述
附录A
（资料性附录）
SN/T2102.2-2008/ISO/TS20836:2005生化性能试验一一测量温度准确度的PCR方法该方法用于试验PCR仪对退火温度控制的准确度，所用试验方法对预设温度与实际退火温度的差异十分敏感。
A.2原理
A.2.1利用预先设计的PCR反应对PCR仪预设/显示温度的准确度进行试验。PCR样品对PCR反应过程中退火温度的升高十分敏感。A.2.2使用标准的M13测序引物对pGEM载体克隆位点的旁侧区域进行扩增，得到362bp含PCR目标位点的DNA序列。：其克降序列见图A，1CAGGAAACAG
AGCTATGCAT
AGTGATTAGC
ATCGAGGTTT
CTCCAACAGC
CGACGTCGGG
CTATGACCAT
CCAACGCGTT
AACCTCGGTA
TTAAAAACCC
CTGATGGCAT
CCCAATTCGC
GATTACGCCA
GGGAGCTCTC
CCATATACTA
CCTCTAGCTA
CAAGTTACAC
CCTATAGTGA
AGCTATTTAG
CCATATGGTC
ACTCGATACA
GCTAGCTAGC
AATCCCGCGG
GTCGTATTAC
GTGACACTAT
GACCTGCAGG
GAAACATCGG
GATTGCTTCA
CCATGGCGGC
AGAATACTCA
CGGCCGCAC
TTGGTGATCG
CCAAGAAGAG
CGGGAGCATG
AATTCACTGGCCGTCGTTTTAC
图A.1用于PCR试验的模板和引物序列A.2.3上述序列为使用M13引物（图中双线部分）扩增改进的pGEM质粒（即pSC17）中的自标序列所得到的。图中阴影部分为验证试验的引物（分别命名为VAL1和VAL2，见A.3.5.3和A，3.5.4），单划线部分为扩增的PCR产物，“T（方框圈示)为一个错配碱基。注：可使用任何与pGEM质粒等效的质粒（或DNA序列）进行试验，A.2.4用琼脂糖凝胶方法能够检测到表明引物VAL1和VAL2扩增得到的116bp的PCR产物。由于引物VAL13端的错配（T与C），使PCR反应对高于预设温度的实际退火温度十分敏感。当退火温度从63℃升高到66℃时即导致PCR扩增失效，无法检测到116bp的扩增片段。反应管应放置在包括临界位置在内的有代表性的温度控制区。对于未确定临界位置的PCR仪，应将样品管随机放置在反应板中心和边缘的不同位置。图A.2为96孔板样品反应管放置实例。1
注：标有a、b和c的位置代表加有5000、500和50拷贝模板的PCR管放置处；N代表无模板的阴性对照。
2PCR反应管在96孔PCR仪上的分布图图A.2
SN/T2102.2—2008/IS0/TS20836:2005A.3试剂
应使用适合分子生物学检测的分析纯试剂。A.3.1水：应使用不含DNA酶和RNA酶的水，也可购买适宜的商业超纯水。A.3.2PCR反应缓冲液（不含MgClz）：10X（150mmol/LTRIS，pH8500mmol/L氯化钾）。A.3.3氯化镁溶液（25mmol/L）。A.3.4dNTP溶液[10mmol/L（四种dNTPs浓度均为10mmol/L)]。A.3.5寡聚核苷酸片段：合成的引物需纯化后方可使用A.3.5.1扩增362bp目标序列的正向引物：M13mp8噬菌体克隆载体（GenBank登录号：M77826.1）。引物 M13(-26):5'-CAg gAA ACA gCT ATg AC-3。A.3.5.2扩增362bp目标序列的反向引物：M13mp8噬菌体克降载体（GenBank登录号：M77826.1）。引物M13(-20):5-gTAAAACgACggCCAgT-3。A.3.5.3试验PCR仪退火温度的正向引物：引物组成有VAL1：5-gATACAgAAACATCggTTggc-3\。
A.3.5.4话
试验PCR仪退火温度的反向引物：引物组成有VAL2:5-gTgTAACTTgATgCCATCAgg-3。
A.3.6质粒pSC17。
A.3.7热稳定DNA聚合酶：用于热启动PCR反应，5U/uL。A.3.8琼脂糖：用于DNA电泳，确定DNA分离片段的大小。A.3.9
硼酸（H,BO）：仅用手配制TBE电泳缓冲液A.3.10
漠酚蓝（CH.Br.OSNa）和（或）二甲苯晴蓝FF（CsH2N,OSNa）冰乙酸（CH?COOH)：仅用于配制TAE电泳缓冲液。乙二胺四乙酸二钠盐（Na2-EDTA.分子式：CioHuN,O.Naz）溴化乙啶（EtBr或C2Hz.N,Br）。丙三醇（CHsO）。
乙酸钠（CHCOONa）：仅用于配制TAE电泳缓冲液。盐酸（HCI）。
氢氧化钠(NaOH)。
3三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)[NH,C(CHOH)]。A.3.18
9TAE电泳缓冲液
A.3.19.1工作液：1X（TRIS0.050mol/L,CH.COONa0.020mol/L,Na2-EDTA0.001mol/L）.用冰乙酸或氢氧化钠调节pH至8.0。A.3.19.2储备液：将TAE缓冲液配制成10X浓度的储备液。如出现沉淀或混浊现象，应倒掉重新配制。配制工作溶液时（1X）用超纯水稀释到指定浓度。A.3.20TRIS/硼酸（TBE)电泳缓冲液。A.3.20.1工作液：0.5X（TRIS0.055mol/L,HBO,0.055mol/L,Naz-EDTA=0.001mol/L)。用盐酸或氢氧化钠调节pH至8.0。
A.3.20.2储备液：TBE缓冲液可配制成10X浓度的储备液。如出现沉淀或混浊现象，应倒掉重新配制。配制工作溶液时（0.5X）用超纯水稀释到指定浓度。A.3.21上样缓冲液：5×（丙三醇50%（体积分数），漠酚蓝2.5g/L和（或）二甲苯睛蓝FF2.5g/L），溶解于电泳缓冲液中（A.3.19或A.3.20）A.3.22溴化乙锭溶液（0.5mg/L）：溴化乙锭溶液应以高浓度（如10mg/mL）在5℃下、避光储存。配制储备液时，应将适量水加到装有预先称量好的漠乙锭粉末或药片的容器中。应在室温避光条件下4
缓慢溶解。可缓缓搅拌，但禁止加热。SN/T2102.2—2008/ISO/TS20836:2005警告：溴化乙锭为潜在致癌物，处理溴乙锭时应戴手套和面具。有条件可使用化学防护头罩。溴化乙锭作为化学有害物应妥善处理A.3.23DNA分子量标准：可使用购买的标准DNA片段混合物（范围从100bp到200bp）。A.4仪器
A.4.1PCR仪。
微波炉或水浴锅，
琼脂糖凝胶电泳装置：包括附件和电源。紫外光透照器或紫外灯：工作波长为312nm。A.4.4
记录仪：可使用图像记录仪（观察3000ASA胶片）、紫外光滤光器（观察溴化乙锭荧光）的等图像记录系统或带有CCD摄像头的图文系统、紫外光滤光器和定量分析软件。A.5
试验程序
制备362bp目的片段
A.5.1.1PCR反应体系
表A1列出了PCR反应体系中各成分的终浓度·该反应体系总体积为50μL。表A.1PCR反应中各成分的终浓度试剂
质粒pSC17
10XPCR缓冲液（无氯化镁）
氯化镁溶液，25mmol/L
dNTP溶液，10mmol/L
引物M13（-26).5μmol/L
引物M13—20）5μmol/L
Taq酶,5U/μL
终浓度
10000个拷贝-6pg
25mmol/L
0.2mmol/L
0.25mmol/L
0.25mmol/L
1U/反应
a如PCR缓冲液中已含氯化镁，则氯化镁在反应液中的终浓度应调至2.5mmol/L2PCR反应条件
所需体积/ul
表A.2列出了PCR反应条件。可根据PCR仪型号和（或）酶的用量适当进行调整表A.2PCR反应条件
预变性
循环数
终伸延
3PCR产物的纯化和测定
2min/95℃
10s/95℃
30s/45℃
20≤/72℃
40个循环下载标准就来标准下载网
2min/72℃
取PCR产物5μL进行琼脂糖凝胶电泳.用漠化乙锭染色观察PCR产物片段大小。剩余PCR产物纯化后用分光光度法或其他适当的方法测定。5
SN/T2102.22008/IS0/TS20836:2005A.5.1.4模板的制备
根据PCR产物的量，通过标准转换公式计算出362bp的拷贝数。将PCR产物制备成1000拷贝/uL、100拷贝/μL和10拷贝/μL三种不同浓度的溶液。不同浓度的目标DNA片段用以下代码表示：-a=1000拷贝/μL（相当于5000拷贝/PCR)；b=100拷贝/uL（相当于500拷贝/PCR）；c=10拷贝/uL（相当于50拷贝/PCR）A.5.2PCR仪性能试验
A.5.2.1PCR反应体系
PCR反应体系为50μL，表A.3列出反应成分及其终浓度。96孔板PCR仪最少应进行16个PCR反应。操作步骤如下：
制备PCR反应混合液；
-将反应混合液分为四份，三份用于PCR反应，一份作为阴性对照（见图A.2）；将制备好的三个不同浓度的模板（a，b，c)分别加入三份PCR反应混合液中；将上述三管加入模板的PCR反应混合液每管平分为五等份，并按图A2的所示分别放置到96孔板的相应位置。
10XPCR缓冲液（无氯化镁）
氯化镁溶液，25mmol/L
dNTP溶液，10mmol/L
引物VAL1.5μmol/L
引物VAL2.5μmol/L
Taq酶.5U/μL
PCR反应试剂加入量
终浓度
3.0mmol/L
0.2mmol/L
0.4μmol/L
0.4μmol/1
1.1U/反应
每个样品体积/μL
a如PCR反应缓冲液包含氯化镁，则氯化镁在反应液中的终浓度应调至3mmol/L。b在阴性对照中.加入5μL超纯水作为模板16个样品推荐体积/μL
将PCR反应混合液分成三个225uL等份和一个50μL的阴性对照。在三个225μL等份中分别加人25μL的a（1000拷贝/μL）、b（100拷贝/μL）、c（10拷贝/μL）模板，混勾后再分别平分为5管（每管50μL），按照图A.2所示放置到96孔板的相应位置。A.5.2.2PCR反应条件
见表A.4。
预变性
循环数
终延伸
A.5.3检测
A.5.3.1概述
PCR反应条件
2min/95℃
10s/95℃
20s/63℃
20s/72℃
40个循环
5min/72℃
可用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，电泳时可使用TAE或TBE缓冲液，但溶解琼脂糖所用的缓6
冲液应与电泳槽中的缓冲液一致。A.5.3.2琼脂糖凝胶的制备、电泳和染色SN/T2102.2—2008/IS0/TS20836:2005称取适量琼脂糖（A.3.8)加入电泳缓冲液（A.3.19或A.3.20)使终浓度为20g/L.凝胶的厚a)
度不可超过1cm；
每管PCR产物各取5μL与1uL样品缓冲液（A.3.21)混匀，分别加到凝胶的上样孔中。在b)
其中的一个上样孔中加入DNA分子量标准液。调整电压，使最大恒定电压小于5V/cm，在室温下电泳；
电泳完毕后.将凝胶浸在溴化乙啶溶液（A.3.22)中，室温、黑暗条件下染色至少30min，也可c
使用其他等效的染色方法；
染色后的凝胶放到紫外光透照仪中（A.4.4）打开紫外灯，通过凝胶成像系统记录DNA荧光。d)
A.6结果的解释
A.6.1将PCR产物与DNA分子量标准（A.3.23)对比可得到PCR产物片段的大小。如果所有扩增产物中都可检测出116bp片段，则表明实际退火温度比设定的63℃高出值小于3℃C。如果没有检测出116bp片段，则可能是实际退火温度比设定温度高出值大于3℃或发生了无效退火反应，这是由于所试验的PCR仪对反应条件控制能力较差造成的，见表A.5。表A.5PCR结果解释
拷贝数
可接受的结果：可检测到的产物5管中的5管
5管中的5管
5管中小于或等于5管
a有50个拷贝数模板的PCR产物中116bp片段的条带可能较弱不可接受的结果：不可检测到的产物5管中小于5管
5管中小于5管
A.6.2若按表A.5解释为不可接受的结果，则需重新试验。如果结果仍确认为不可接受的结果，说明仪器性能出现故障，需进行物理试验。SN/T2102.2—2008/IS0/TS20836:2005附录B
（资料性附录）
性能试验的物理方法
B.1概述
物理性能试验是通过记录反应管中液体的温度来验证PCR仪在运行过程中温度的准确度。B.2原则
使用热电偶或其他元件记录反应管中水的温度。物理性能试验在PCR仪运行时进行，试验内容包括一个PCR循环中的三个温度（即变性，引物退火和引物延伸）。有热盖的PCR仪在试验时热盖应同时处于工作状态。
B.3试剂
B.4仪器
B.4.1PCR仪。
B.4.2温度记录装置：包括测温探针，导线和温度记录仪。使用时将温度记录装置校准到指定的温度范围。
B.5试验程序
B.5.1试验方法
将测温探针放到PCR仪多孔板中有代表性位置，应重点考虑临界位置。如临界位置未知，则应将探针随机放置在多孔板中。如：对于一个96孔的PCR仪，将整个区域分为6等份，每个等份中至少放置2个探针，这样即可得到至少12个点的试验结果。B.6测温记录
测温频率为每个位点每秒钟应至少记录一次。每次对上述的三个连续温度至少试验30个循环。对于每个被测位点，应记录三个连续温度（变性，退火和延伸温度）中每个温度的起始温度和终止温度t的最高值与最低值的平均值
B.7测温结果的解释
每个位点的试验结果都有二个最高温度和最低温度，两个温度都应在技术手册中规定的范围内，如果没有给出温度的准确值，则要求实际温度与仪器设定温度的偏差小于0.5℃。此外，PCR仪的实际温度在整个循环过程中每一步都应保持在规定的范围内。不符合上述要求的PCR仪不应使用8
Preface
SN/T2102.2—2008/ISO/TS20836:2005Polymerase chain reaction(PcR)forthe detection of food-bornepathogens are series standards.in-cluding4partslistasfollows:
Part 1:General requirements and definitions;-Part2:Performancetestingforthermal cyclers-Part3:Requirements forsamplepreparation forqualitativedetection;Part4:Requirementsforamplificationanddetectionforqualitativemethods.This Standard is the second part of thestandardThe consistency degree of this standard and IS0 220836:2005(E)is identification,the main showingbellows
-ModifyForewordDeleteIntroductionoforiginalstandardModify\Normativereferences\accordingtotheGB/T1.1；-Substitute the International standard with National standard or SN standard.For example Substi.tuteISO17025withGB/T17025;
ModifytheexpressivemodeofreagentinAppendixA.3toChinesemode;SubstituteWARNINGwithSafetyprecaution,andputitattheendofthispart;Deletebibliographyattheendof thispartAnnex A and Annex B of this part is informative.This part was proposed and administrated by National Regulatory Commission for Certification andAccreditation.
This part was drafted by China Import and Export Commodity Inspection Technology Institute,ShanxiEntry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine BureauJilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangdong Entry-Exit Inspection and QuarantineBureau.ShandongEntry-Exit InspectionandQuarantineBureau
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