【商检行业标准(SN)】 食源性原体PCR检测技术规范 第1部分：通用要求和定义

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2102.1—2008/ISO22174:2005食源性病原体PCR检测技术规范
第1部分：通用要求和定义
Polymerase chain reaction(PCR)for the detection of food-borne pathogens-Part 1:General reguirements and definitions[ISO 22174:2005,Microbiology of food and animal feeding stuffs-Polymerase chain reaction(PCR)for the detection of food-borne pathogensGeneral requirements and definitions,IDTJ2008-07-17发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2009-02-01实施
SN/T2102.1—2008/ISO22174:2005SN/T2102《食源性病原体PCR检测技术规范》共分为四个部分：第1部分：通用要求和定义；
第2部分：PCR仪性能试验要求；第3部分：定性检测方法样品制备要求；第4部分：定性检测方法扩增和检测要求。本部分为SN/T2102的第1部分。
本部分等同采用ISO22174：2005《食品与动物饲料微生物学食源性病原体PCR检测通用要求和定义》，并做了如下编辑性修改：对“前言”和“引言”进行了修改；对\规范性引用文件”的描述按照GB/T1.1的要求进行了修改；将标准中的部分“注”按中文标准习惯改为正文：-将标准中的国际标准用相应的国家标准或行业标准替代，如：GB/T27025代替ISO）17025：将“警告”改为“安全要求，并放置到标准的末尾段”。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分由中华人民共和国山西出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国内蒙出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局负责起草。Www.bzxZ.net
本部分主要起草人：李卫华、李晓虹、刘中学、蒋原、曹际娟、王海艳。本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。http
SN/T 2102.1—2008/ISO 22174:2005引言
聚合酶链式反应（PCR)具有快速、灵敏和特异的优点，利用PCR技术进行食源性微生物的检测方法近年来发展十分迅速。
根据所要扩增目标核酸的类型，可将PCR技术分为DNA扩增（反转录PCR)和RNA扩增（PCR）两大类，并以上述两类PCR技术为基础，发展和衍生出了多种PCR检测技术。ISO22174：2005，由欧洲标准委员会（CEN）食品分析——水平方法技术委员会（CEN/TC275）与食物产品技术委员会（ISO/TC34）微生物小组委员会（SC9）依照ISO和CEN技术合作协议联合制定本部分等同采用ISO22174：2005.为《食源性病原体PCR检测技术规范》的第1部分。提出了食源性病原体体外PCR扩增和检测的通用要求，并确保不同的实验室得到检测结果的可比性和可重复性。http://www。
1范围
SN/T2102.1—2008/ISO22174:2005食源性病原体PCR检测技术规范
第1部分：通用要求和定义
SN/T2102的本部分规定了体外核酸序列(DNA或RNA)扩增的通用要求。规定了检测食品和食品分离物中病原体的PCR方法。
本部分适用于食品和饲料中病原体检测，也适用于其他样品（如环境样品）和非病原微生物的检测。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过SN/T2102的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分GB/T27025检测和校准实验室能力的通用要求SN/T2102.3食源性病原体PCR检测技术规范第3部分：定性检测方法样品制备要求SN/T2102.4食源性病原体PCR检测技术规范第4部分：定性检测方法扩增和检测要求WS/T230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用3术语和定义
下列术语和定义适用于SN/T2102的本部分。3.1常规术语
核酸nucleic acid
作为遗传信息介质或信息表达因子的生物大分子。核酸有DNA和RNA两种类型。3.1.2
脱氧核糖核酸deoxyribonucleicacid，DNA以双链或单链形式存在的脱氧核糖核苷酸聚合体。3.1.3
核糖核酸ribonucleic acid,RNA以双链或单链形式存在的核糖核苷酸聚合体，3.1.4
基质matrix
用于分析的样品，这些样品在化学组成或物理状态上可能存在差异。3.1.5
repeatability conditions
重复性条件
同一操作者在同一实验室使用相同的仪器和方法在较短时间间隔内获得独立结果的条件。3.1.6
reproducibility conditions
再现性条件
不同操作者在不同实验室使用不同仪器和相同方法检测同一个项目得到检测结果的条件。1

SN/T2102.1—2008/ISO22174:20053.1.7
检测detection
识别是否存在目标核酸的过程。3.1.8
检出限detection limited
在方法规定的实验条件下稳定地检测出定量样品中目标微生物最低的浓度或含量。3.1.9
identification
确定某一分离产物特定属性的过程。3.2与DNA/RNA提取和纯化相关的术语3.2.1
nucleic acid extraction
核酸提取
释放目标核酸的样品处理过程
核酸纯化nucleicacid purification能得到更为纯净DNA的方法。本部分中的“纯化”是指减少PCR反应显著抑制因子的过程。3.2.3
PCR qualityDNA
DNA模板质量
用于PCR反应DNA模板的有效长度和拷贝数量3.2.4
RNA模板质量RT-PCRqualityRNA
用于反转录PCR的RNA模板的有效长度租拷贝数量3.3RNA到DNA反转录相关术语
反转录reverse transcription.RT在反转录引物参与下，在反转录酶作用下.以RNA为模板：以三磷酸脱氧核糖核苷酸（Dntp）为底物合成DNA的过程。
反转录酶
reverse transcriptase
使用反转录引物，催化RNA反转录为DNA的酶，3.3.3
核糖核酸酶ribonuclease
降解RNA的酶。
核糖核酸酶抑制剂ribonucleaseinhibitor抑制核糖核酸酶活性的物质。
反转录引物RT-primer
用于反转录反应的引物。
反转录反应混合物
反转录所需的反应混合试剂。
合品伙伴网ht
SN/T 2102.1—2008/1SO22174:2005三磷酸脱氧核糖核酸deoxyribonucleosidetriphosphate，dNTP含有脱氧腺嘌呤核酸（dATP）、脱氧胞嘧啶核酸（dCTP）、脱氧鸟嘌呤核酸（dGTP）、脱氧胸腺嘧啶核酸(dTTP）和/或脱氧尿嘧啶核酸(dUTP)的溶液3.4与DNA扩增（PCR/RT-PCR）相关的术语3.4.1
聚合酶链反应polymerasechainreaction，PCR体外扩增DNA的酶促反应过程。
反转录聚合酶链反应RT-PCR
包括RNA反转录为DNA和PCR扩增两步反应。3.4.3
一步反转录聚合酶链反应
one-step RT-PCR
将RNA到DNA的反转录和PCR反应同时进行的方法3.4.4
两步反转录聚合酶链反应two-stepRT-PCR将RNA到DNA的反转录与PCR反应分开进行的方法。注：两步反转录PCR法可在同一反应管中先后进行·也可分开两管进行。3.4.5
PCR产物PCRproduct
PCR扩增的DNA片段。
PCR产物的检测detectionofPCRproduc观察PCR产物产生信号的过程
PCR产物的确认confirmationofPCRproduc证实从目标序列中所获得的PCR产物的过程3.4.8
聚合酶链-酶联免疫吸附法PCR-ELISA将液相PCR产物包被到固相载体（如固定在多孔板的反应孔中）上进行检测的方法。可通过杂交和酶联免疫显色方法观察PCR产物3.4.9
热启动PCRhot-startPCR
用初始加热步骤激活热稳定DNA聚合酶，以此避免非特异性DNA扩增。3.4.10
嵌套式PCRnestedPCR
以第一步PCR产物为模板进行的第二步PCR反应的过程。3.4.11
多重PCRmultiplexPCR
使用多对引物进行的PCR反应
引物primer
有固定长度并与待扩增日标DNA存在互补序列的寡聚核苷酸。http
SN/T2102.1—2008/ISO22174:20053.4.13
目标 DNADNA target
用作扩增的DNA序列。
变性 denaturation
双链DNA解链为单链DNA的过程。3.4.15
退火annealing
引物与其互补核酸序列在特定条件下结合的过程。3.4.16
primer extension
引物延伸
在引物序列的3'端加入单股脱氧核糖核苷酸链形成新DNA双链的酶促反应过程。3. 4. 17
DNA聚合酶DNApolymeraseforPCR催化DNA反复合成的热稳定酶。
PCR反应混合液mastermix
除目标DNA和对照外的其他PCR反应成分。3.4.19
尿嘧啶N-糖基化酶uracilN-glycosylase，UNG分解核酸序列中脱氧尿嘧啶(dUTP)的酶。3.4.20
thermal cycler
PCR仪
运行PCR反应温度转换程序的自动装置。3.4.21
终点分析 endpoint analysis
测定PCR产物的定性分析。
实时分析real-timeanalysis
在扩增过程中对PCR产物的量进行跟踪检测的分析方法。3.5与对照相关的术语
positiveprocess control
阳性过程对照
添加了目标微生物的样品，其处理方法与检测样品相同。3.5.2
阴性过程对照
negative process control
使用不含目标微生物的食品基质作为整个检测过程的对照。注：检测过程包括样品制备、富集，DNA提取和目标序列扩增。3.5.3
扩增对照amplification controls3.5.3.1
internal amplification control内扩增对照
将一定量或拷贝数的已知DNA添加到每个PCR反应体系中，作为扩增反应的内部过照。http:
外扩增对照externalamplificationcontrolSN/T2102.1-2008/ISO22174:2005将一定量或拷贝数的目标DNA添加到等量的提取核酸中，作为单独的扩增反应对照。3.5.4
阴性提取对照/提取空白
negative extraction control/extraction blank在DNA提取过程中不使用检测样品的对照。3.5.5
positivePCRcontrol
阳性PCR对照
含一定量或拷贝数日标DNA的PCR反应对照。3.5.6
阴性PCR对照negativePCRcontrol以不含反应抑制剂和DNA的超纯水替代样品DNA的PCR反应对照。3.6与DNA探针有关的术语
DNA探针DNAprobe
与待测目标DNA具有特定杂交序列的标记核酸分子。3.6.2
封闭液blockingreagent
封闭杂交膜上非特异性结合位点的化合物。3.6.3
杂交hybridization
互补核酸序列在适当反应条件下特异性结合的过程3.6.4
特异性
specificity
识别目标序列，并将目标序列与相似物和杂质进行区分的特有能力。4原理
4.1概述
检测过程包括以下连续的步骤：a）需要时，对检测样品中食源性病原体进行富集（见4.2）；b)
需要时，进行核酸的提取与纯化（见4.3）；通过PCR法，使用特异性引物扩增目标序列（见4，4）；c
d）检测特异性PCR产物（见4.5）。4.2病原微生物的富集
需要时，可使用能促进目标微生物生长的非选择性营养液体培养基对样品中的食源性病原体进行增菌，增加待测微生物的数量，以便于检测。可使用过滤和/或浓缩等方法对病毒进行富集4.3核酸的制备
将检测样品或增菌液中的微生物细胞溶解，释放出DNA。需要时在细胞溶解前对微生物进行分离，并/或在细胞破碎后对其DNA进行纯化。4.4PCR扩增
特定核酸序列可通过PCR方法扩增。通过PCR法检测RNA时，可先将RNA序列反转录为相应
SN/T2102.1—2008/ISO221742005的拷贝DNA（cDNA）。PCR反应是包括以下三个步骤的循环的过程：a）变性：双链DNA变性后解链为单链（ssDNA）：b）退火：引物退火，与模板上的目标序列互补结合：c）延伸：在热稳定DNA聚合酶作用下，在引物上合成新的DNA链注1：双链DNA变性后.两条寡核苷酸引物退火，与目标片段结合并开始扩增。两条引物方向相对.进行目标序列扩增！注2：在热稳定DNA聚合酶的作用下，引物和目标序列的碱基配对.并沿3'端延伸，形成双链结构，注3：变性，引物退火和DNA合成三个步骤反复循环，DNA片段以指数形式扩增，4.5PCR产物的检测和确认
采用凝胶电泳或其他适当的方法可对PCR产物进行检测。需要时可通过适当的方法（如：测序）对PCR产物进行确认
5检测样品
所提取的核酸溶液中不含PCR反应抑制剂的所有食品或动物饲料均可作为检测样品。6实验室通用要求
6.1概述
浮尘或气溶胶能造成意外的DNA污染，实验室应具备合理的工作区域并让工作人员养成以下良好的操作习惯，以保证样品中和扩增出的DNA不受污染。一一影响检测结果的每个步骤都应在封闭的环境中进行操作：应在单向气流条件下处理样品。6.2操作人员
6.2.1培训要求
所有检测人员应进行适当的PCR知识和微生物学知识培训6.2.2检测要求
在PCR各检测区域应更换实验服：制备样品和设置PCR反应条件时应戴一次性手套：检测过程中应按适当频率更换实验服和手套6.3实验室设施
6.3.1概述
为防止反应液被前次扩增的目标DNA污染，实验室应具备足够的独立工作区域和与之配套的专用器具。
6.3.2工作区域和操作器具
实验室应至少具备四个独立的工作区域并确保每个区域具有所需的专用器具：从样品中提取核酸的工作区域：a
制备PCR反应混合液的工作区域
将核酸加人PCR反应混合液的工作区域：d）检测和确认PCR产物的工作区域。PCR扩增可在工作区c)或d)中进行。如PCR仪放在c)区，则含有反应产物的PCR管不能在c)区打开。制备样品DNA和反应混合液的反应管应分开使用。实验操作应在洁净的环境中进行。确保各工作区域和其设施独立的最有效、最可取的方法是对不同区域进行物理隔离。注：可使用3%（质量分数）的次氯酸盐溶液降解PCR产物：6.4废弃物管理
废弃物处理参见标准WS/T230：临床诊断中聚合酶链反应（PCR)技术的应用6
h
7试剂
参见SN/T2102.3和SN/T2102.4。8仪器和设备
SN/T2102.1—2008/ISO22174:20058.1概述
实验室的常规仪器应按照生产商的使用说明书和GB/T27025要求进行仪器的维护。特殊仪器的维护要求可参照该仪器的相关标准。8.2特殊要求
应对可能影响检测结果的仪器进行定期校准，保证检测结果的准确性。9检测步骤
9.1样品制备
需要时可参照SN/T2102.3中的方法进行样品中的细胞破碎、核酸提取和纯化。9.2扩增
将待测目标核酸加人到PCR反应混合液中，按照方法设置PCR反应的温度/时间和循环次数，并做适当的对照反应，保证PCR反应混合液中无反应抑制剂存在9.3对照反应
用PCR方法检测食源性病原体时需做适当的对照，如表1所示。每个PCR检测反应都应包括阳性PCR对照（含日标DNA序列）和阴性PCR对照（不含月标DNA序列）。当一种对照达不到预期结果时，应按照表1的规定在适当的时间间隔加入其他附加对照。样品PCR检测对照反应
样品处理
核酸提取
阴性过程对照
阳性过程对照
（3.5.1)5
：可作为实验质量保证计划的一部分b使用阴性过程对照时可省略。
C每个PCR反应都应做。
d每批样品的PCR反应都应做
注：表示此步骤包括本对照反应。阴性提取对照
内/外扩增
阳性PCR
对照d
阴性PCR
9.4PCR结果的确认
检测出的PCR产物和产物的特异性需进行适当的确认（见4.5）。阳性PCR结果还应使用培养法进行确认。
10评估
通过评估，能够确认9.3中规定的对照反应的结果。表2列出了PCR检测可能的结果和对结果的相应解释。
合品伙伴网htt
SN/T2102.1—2008/ISO22174:2005被测样品
阳性过程
阳性PCR
a可能有阳性污染。
b可能存在PCR扩增抑制物。
表2PCR检测结果
阴性过程对照；阴性提取
对照：阴性PCR对照
注：“+\可检测到PCR产物，“-”不能检测到PCR产物11
检测报告
内扩增
检测报告需符合GB/T27025的要求，并且至少应包括以下内容：能够识别检测样品的所有信息；与检测样品相关的特殊细节（如：缺失部分大小，降级状态等）；检测的参考标准及所用方法；
样品接收日期：
样品贮存条件：
检测起/止日期；
检测人员；
每份检测样品的量；
检测结果：
检测过程观察到的特殊情况：
与检测规范的所有偏离，与特殊检测有关的其他所有信息。12安全要求
外扩增
结果解释
不确定”
不确定
本部分未列出使用中涉及到的所有安全问题。操作者在使用本部分时可能受到由有害物质、仪器设备和操作不当所造成的危害，实验室管理者应预先建立适宜的安全健康规定，以避免危害的发生。http:
Preface
SN/T2102.1—2008/ISO22174:2005Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens are series standards, in-cluding 4 parts list as follows:-Part 1:General requirements and definitions :-Part 2:Performance testing for thermal cyclers;Part3:Requirements forsamplepreparation forqualitativedetection-Part 4:Requirements for amplification and detection for qualitative methods.This Standard is the first part of these series standard.The consistency degree of this standard and IS0 22174:2005 is identification, the main showing bel-lows:
-Modify Foreword,Delete Introduction of original standardModify“Normativereferences\accordingtotheGB/T1.1-Change some note to text according to the Chinese custom:-Substitute the International standard with National standard or SN standard. For example Substi-tuteISO17025withGB/T27025：
Substitute WARNING with Safety precaution, and put it at the end of this part.This part was proposed and administrated by National Regulatory Commission for Certification andAccreditation.
This part was drafted by Shanxi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai Entry-Exit In-spection and Quarantine Bureau, Neimenggu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, JiangsuEntry-Exit Inspection and Quarantine Bureau and Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bu,reau.
Main drafters of this standard are Li weihua, Li xiaohong, Liu zhongxue, Jiang yuan ,Caojijuan and合品伙伴
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