【SN商检标准】 入出境动物皮张携带鼠疫耶尔森氏菌快速检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3888--2014
入出境动物皮张携带鼠疫耶尔森氏菌快速检测方法
Rapid deteclion of Yersinia pestis from entry-exit animal skins2014-01-13 发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-08-01实施
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草本标准用国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3888—2014
本标准起草单位：中华人民共和国内蒙古山入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。
本标准主要起节人：养舜、魏怀波、用丽、葛润平、郭文霞、王东胜、郝广福、张胜T
1范围
入出境动物皮张携带鼠疫耶尔森氏菌快速检测方法
SN/T 3888—2014
本标准规定了入出境动物皮张携带鼠疫杆菌的样本采样、保存及反相间接血凝试验和聚合酶链反应试验的快速检测方法。
本标准适用于人出境旱懒孤狸狼狗摩鼠、灰鼠等可能感染鼠疫杆菌的动物皮张及寄生物的病原体检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求WS279鼠疫诊断标准
国务院令第424号病原微生物实验室生物安全管理条例3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
animalskins
动物皮张
可能携带鼠疫杆菌的旱皮、狐狸皮、狼皮、啥猜皮、瞬鼠皮灰鼠皮等。4实验室条件及防护要求
4.1准则
检测标本的处理和保存应在BSL-2级以上实验空中进行。BSL-2级以上实验室的要求要符合GB19489和《病原微生物实验室生物安全管理条例》中同级别实验室的要求，并按照以上两个文件的要求来进行个人防护。检测方法主要参考WS279。4.2个人防护
采用实验室二级防护标准。
4.3实验仪器设备www.bzxz.net
生物安全柜、DNA扩增仪、凝胶成像分析系统、电泳仪、高压灭菌器、电子天平、水浴锅、恒温箱、V孔板、移液器、不锈钢剪刀、打孔器1
SN/T 3888—2014
5样本的采集和保存
5.1梳检寄生物
在大白盆内(或1 m×1.m 的自布单)梳检生物,将检到的寄生物置于样品管内保存。5.2取样部位
选择得检皮张的头颈尾部，四肢各个部莅，有血液，淋巴给附着部位优先采样，5.3取样方法
每张皮张按头颈部、四肢、尾部不同部位分别取1crm大小的样本6块，用1Ucm×15tI塑料封口保存；血渍淋凹结的部位用刀片刮取血渍，于10 mL带盖离心管内保存，5.4样本存放
采集到的样本放置下一20℃冰柜或低温冰箱中冷冻保存，待检。5,5样本处理
5.5.1反相间接血凝试验(Reverse indirecl henagglutination assay.RIHA)样品处理方法粉碎样本，加牛埋盐水漫没，浸泡21h。吸取漫泡液1500r/nin离心5min，吸取1.清液，56灭活3min后制股样液，备检。
5.5.2聚合酶链反应(Polyimerase Chain Kcaction,PCR)试验样本处理方法5.5.2.1取 1 g龙胆紫，先用 2 ml.酒精溶解后,加蒸馏水至 100 mL，混,取此溶被 10 ml.加人99 mL蒸馏水制备成 1 g/I.龙胆紫液;取 2 g NaCl加人 100 mL蒸馏水中,取此液 100 mL加人 1 g/L龙胍紫液 0,5 InL,混匀后,分装高压火菌 30 min,配制成洗蚤液备用，5.5.2.2粉碎样本，用双蒸水没没，没泡24h。吸取浸泡液1500r/min离心5min，吸取上清液，56℃火活30 in后制成样液，备检蛋、蜱、螨等寄生物样本置于研蚤板L.孔内，用洗蛋液反复清洗T净，弃去清洗液,研磨后用生理盐水按照【00 μIL,只蚤（螨）、500 L/只蜱比例制成悬液，1 500 r/min 离心5 min,吸取上清液,56 ℃灭活 30 min后制成样液,备检。6检测方法
反相间接血凝试验(RIHA)）
6.1.1试剂
6.1.1.11%鼠疫F1抗体致敏而球。6.1.1.2抑制剂为1：100稀释的鼠疫免疫血清。6.1.1.3阳性刘照血清:阴性混合血清 FI 抗原至 1 mg/mL,1 100稀释后作为阳性对照。6.1.2标本准备
按照 5.5.1 准备标本,
TKAONiKAca
6.1.3初筛试验操作步骤
6.1.3.1每份被检液在V型孔微量血凝板稀释5孔。6.1.3.2用移液器向每孔分别加人25μl.稀释液。SN/T 3888—2014
6.1.3.3在第1孔扣加人被检液25L吸排4饮~6次，充分混寸，取25.移垒第2孔，充分混匀，依饮稀释牟最后一孔,弃掉25L。
6.1.3.4分别在各孔内加人1%鼠疫 F1抗体致敏血球25 μL,振荡混勾，置 37 ℃温箱或室温 2 h后观察结果。
6.1.4结果判定
6.1.4.1“#”：凝集血球铺满孔低，有明显折边·抗体过量时，凝集呈疏松花圈状。6.1.4.2*1”：凝集血球铺满孔低，无折边。6.1.4.3“十十”：血球不完全凝集,孔底呈整齐的圆圈状,们菌内外有明显的血球凝集。6.1.4.4=十”:孔底形成较小的圆,在圈内外只有很少的血球凝集。6.1.4.5*”血球全部沉积在V型孔的底部，是整齐的小珠状。6.1.4.6呈现\十十\以上的凝集现象时,进行复判操作，6.1.5反相血凝的确证试验(复判)6.1.5.1每份初筛阳性的被检材料在V型孔微量血凝板做二列复判试验，第一列为抑制列,第一列为凝集列。
6.1.5.2用移液器向抑制列每孔加人 25 μL抑制剂,问凝集列每孔加25 μL稀释液。6.1.5.3分别向每列第1孔中加人被检液25μ1.,两列分别进行倍比稀释，方法同6.1.3.3.至每列最后--孔弃 25 μI.,室温作用 15 min。6.1.5.4各孔内加人1%鼠疫F1抗体致敏血球25μI，振荡混匀,置37℃温箱或室温2 h后观察结果6.1.5,5设置对照：
空白对照：稀释液25L11%鼠疫F1抗体致敏血球25μLa)
b）朗性对照：被检液25μL1%单宁酸血球25μLc）阳性对照:阳性对照血清+1%鼠疫 F1抗体致敏血球 25 μL。6.1,5,6结果判定：方法同6.1,4。最终结果，空白对照，阴性对照孔不出现凝集现象，阳性对照成立。当抑制列呈“十十”凝集的孔比试验列少2孔以上，判定为特异性凝集。阳性最效价为凝集排呈现“一十\的最高稀释度。
6.2聚合酶链反应(PCR)试验
6.2.1溶液及电泳胶体制备
6.2.1.10.5mol/1.EDTA(pII8.0):在800 ml.蒸馏水中加人186.1gEDTA,在磁力搅拌器上搅拌,用NaOH(约20 μ)调 pH至8.0。然后定容至 1 J. 分装后高压灭菌备用。6.2,1.25×TBE 储存液,如下：
0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)
蒸馏水
补牟 1 000 ml
6.2.1.3琼脂糖凝胶：1%琼脂糖.冷却至50℃:~-60℃，每100 mL加人5μLGoldview染料，倾注3
KAONiKAca
SN/T3888-—2014
胶体。
6.2.2目标基因
6.2.2.1从疑似鼠疫的标本中检测鼠疫菌时，以鼠疫菌的fra及pla二基因的片段作为PCR扩增的目标基因。
6.2.2.2针对上述目标基因采用的引物序列和扩增产物的长度如下：H标基因
引物序列
IF5-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3
1R5-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3
2F5-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-32R5-GTGACATAATATCCAGC
GTTAATT-3
产物长度
上述引物合成后如为冻干状态，短暂离心后打开，加人适量灭菌三蒸水混合均匀配制成浓度为6.2.2.3
100μmol/L的储存液，一20保存使用前配制成10μmol/1度的工作液。6.2.3内部对照
6.2.3.1内部对照以鼠疫菌EV株DNA为模板，采用上述1F和1R引物首先扩增出fra基因249bp片段，再以16SrRNA基因引物
F5'-AGCGGCAGCGGGAAGTAGTT-3
R5'-TCAACCCCTTCCTCCTCGCT-3
扩增出16SrRNA基因396bp片段。采用TOPOIACloningKit克隆fra基因片段，鉴定为阳性的克隆子质粒采用HpaT酶切，再以T4DNA连接酶将16SrRVA基因片段连接在上述质粒的缺口中。连接后的质粒再次克隆。成功插人fra和16SrRNA基四片段的质粒作为内部对照模板。6.2.3.2按上述方法建成的内部对照模板，根据测定的质粒含量配制成浓度为0.56ug/mL的工作溶物扩增的产物长度为615
液。该对照模板以上述的1日
6.2.4试剂保存
引物、dNTP、TaqDNA聚合
酶、Gollview染料、分子量标准（marker）保存于一20℃，均应尽量减少冻融次数。
6.2.5标本处理
按照5.5.2准备标本。
5PCR反应体系（总量25μL）
采用其他总量时，下列配方按比例改变无菌去离子水
10×反应缓冲液
4XdNTP混合物（每种2.5mmol/L)引物（1F、IR、2F、2R）
内部对照模板（IC）
待测标本
TaqDNA聚合酶
Tag DN入聚合酶应在临用前取出，使用前置与冰上，最后加入反应体系，加入完毕后尽快将酶收回冷冻保存，并立即短暂离心反应体系后开始扩增。TKAONIKAca
6.2.7扩增
SN/T3888—2014
预变性95℃5min；然后95℃1min，55℃1min，72℃1min.30个循环：最后保持72℃5min。共100min。
6.2.8电泳
6.2.8.1反应完毕后.向反应管中加人溴酚蓝指示剂5μL，混合均匀，短暂离心。6.2.8.2向电泳胶体的每一孔中加入上述处理的反应产物8L，每一板胶体至少在边缘的2孔中加分子量标准。
6.2.8.3按照5V/cm电压下在TBE缓冲液中电泳6.2.8.4用凝胶成像仪读取结果并照相6.2.9判断结果
无凝胶成像仪时可在紫外透射灯工下观察结果并用相机照相。
6.2.9.1电泳后显示衍合249bp、456bp及645bp度的3条带型者为阳性；显示一条目标条带与对照条带者为鼠疫弱毒菌：只显示645bp一条带者为阴性。6.2.9.2显示多数、不规则条带，并与上述预计长度均不相等者（排除实验因素干扰）为阴性。6.2.9.3
阳性结果样品应通过对扩增产物进行核酸序列测定以确定最终结果。S
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