【农业行业标准(NY)】 花卉植物寄生线虫检测规程

ICS 65.020.01
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1280—2007
花卉植物寄生线虫检测规程
Rules for Detection of Plant Parasitic Nematodes on Ornamental Plants2007-04-17发布
2007-07-01实施
中华民共和国农业部发布
规范性引用文件
符号和缩略语
试剂与材料
6调查捆样方法
样本采集
样木类型
7.2样本采集巢
8检验方法
8.1症状观察
8.2病原线虫分离
8.3线出标本的制作和保存
8.4线虫的形态鉴定
9结果判定
附求A（规范性附录）花卉植物寄生线虫形态特征A.茎线出属
腐烂茎线虫
鳞球茎茎线虫
A.2粒线虫属
A.2.1剪股颗粒线虫
A.3根结线业属
A.4螺旋线虫属
A.5矮化线虫属
A.5.1杜鹃衰退病线虫
A.6穿孔绒虫属
A.6.1香蒸穿孔线虫
肾形线虫属
A.8短休线虫属
A.8.1咖啡短体线虫·..
A.8.2卢斯短体线虫
穿刻短体线里
伤残短体线虫，
A.9假根结线虫属
NY/T 1280—2007
NY/T 1280--2007
A.9.1异常假根结线出
A.10盘旋线虫属.
纽带绒业属
A.12胞装线业属
A.12.1甜胞囊线虫
A.13仙人掌随囊线虫属
球胞囊绒虫属
马铃薯白线虫
马铃薯金线虫
刺线虫属…
小环线出属
半穿刺线虫属Www.bzxZ.net
针线虫属
滑刃线虫扇，
水稀于尖线虫
菊花叶枯线虫
A.19.3草莓滑刃线虫
A.20伞滑州线虫属
A.20.1松材线虫
A.202椰子红环腐线虫
长针线虫属.
附录B
附录（
拟长针线虫属
剑线虫属·
毛刺线虫属
拟毛刺线虫属
(规范性附录）
（规范性附录）
FAA固定液
FA 4:1 固定液
花卉线虫形态特征及其为告状
固定、保存液等溶液配方
中醛甘油固定液
C.4 AFG 双倍液
FC线山保存液
FAG线虫保存液.
乳酚油快速脱水液
C.8甘油缓慢脱水液
C.9鲁果氏碘液
.10多色蓝染液
石鳍凡士林混剂
甘油明胶冻封固剂
本标准由中华人民共和国农业部提出并归。言
本标准的附录A、附录B和附录C为规范性附录。NY/T 1280—2007
水标准由农业部花卉产品质量监督检验测试中心(广州)负责起草，农业部蔬策品质检测中心(北京)参加起草。
本标准土要起草人：周晓云、梁扬辉、刘、曾伟达、曾武清、谢向坚、陈瑞清、廖娇女。1范围
花卉植物寄生线虫检测规程
本标谁规定了主要花卉植物常见寄生线业的检测方法。本标准适用于主要花弃植物常见寄牛线虫的检测。2规范性引用文件
NY/T 1280—2007
下列文件中的条款通过本标准的学用而成为本标准的条款。凡是注只期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用干本标准，然雨，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注口期的引用文件，其最新版本适用于本标准，CB/T6682分析实验空用求规格和试验方法GB15569-1995农业植物调运检疫规程3特号和缩略语
测计的样本数；
L体长,单位为微米(am)；
w----体宽，单位为微米(am)；
体长/最大体宽：
b-—体长/体前端至食道与肠连接处的距离：h
一体长/体前端至食道腺木端的距离：背食道腺开口到口针基部球的距离，单位为微米(μm)：X-
-体长/尾长；
——尾长/肛门处休宽；
V——（体前端至阴门的距离/体长）×100；stylet—一口件长度,单位为微求(μm)；产
（口针针锥部长度/日针长度）×100：taillegth——尾长，单位为微米(um)：T——（泄殖腔口至精巢末端的距离/体长）×100；G1一（阴门至前尘殖腺末端的距离/体长）×100；Gz=（阴门至后生殖腺末端的距离/体长）×100；spiculelenguh—交合刺长度，单位为微米（um）;gubernutulun length
一引带长度，单位为微米（un）：M-
口针创锥部长/口针长；
h—-尾后部的透明区长度，单独为微求(um)；R—-体环数；
RP一-体中部的1个休环宽；
RV=阴门与尾端之间的体环数：
Ra肛门与尾端之间的体环数；
-肛门与阴门之间的体环数
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4仪器
4.1小铲、镊子剪刀、斧头、锯子等。4.2护大镜、双目解剖镜。
4.3漏斗、浅盘Fenwich-Oostenbrik胞燃漂浮器。4.4微量移液器、尖头镊子、酒精灯、恒温水浴箱、干燥器、电热板等。4.5显微镜。
5试剂与材料
如无特殊指明，本标准中所用试剂均为化学纯，水为符合GB/T6682规定的三级水：所用试剂和溶液配方见附录C。
6调查抽样方法
按照GB/T15569-1995表1的规定逃行随机抽样调查7样本采集
7.1样本类型
罹病植物、根际土壤或介质。
7.2样本采集
7.2.1植物症状明显时
来集病变部位不少乎50，根际士壤（或介质）不少于1000g。7.2.2植物症状不明显时
对于花卉种苗或小型植株，整株采样；-般盆花作为个样本采样；人型植物环形五点取样，短点取不少丁200g的根际上壤。田间或盆栽花卉或种苗，按6的规定随机采样，将调查抽取的样品混个后取不少于100待检植物的新根（或营养根)和不少于1000g植物根际土壤（或介质)作为1份样本，份样本所含株或数应符合CR/T15569-1995中表3中节木奖的规定。8检验方法
8.1症状观察
详细为害症状见附录A。
8.1.1地上部症状观察
寄尘线虫危害植物地上部，引起地上部特异性症状有死芽、器官崎膨、种瘦、邮瘦，叫瑶、坏死等。寄牛线虫危害销物地下部，引起地上部作特导性症状有生长不良、矮化、黄化、要煮、叶片褪绿等。8.1.2根部症状观察
对丁地上表现有可疑症状的植物，挖取其根部，观察是否有根结或根瘘、粗短根等，有些是非特异的，如根系衰退根褐变、根腐烂等。8.2病原线虫分离
8.2.1直接解剖法
分离根部固若寄生的线虫，先把根洗净、剪成1cr~-2cm小段，放在盛有适量水的培养血中，衣双用解剖镜下，用镀了将夹持，用解剖针轻轻挑元根纽织，将膨人的雌虫小心挑出，再用吸管将线负吸出、收集起来。
此法适用于分离在植物组织中营固若寄生的线虫，如l根结线虫（Meloidog3mespp.）胞赛线虫（Het2
predera spp.),球胞获线虫(Globorteru.spp:)和肾形线虫(Rotylenchutus su.)等。8.2.2直接浸泡法
NY/T 1280—2007
将病组织剪成小段或渐开，放人小培养血中，如清水,援袍一段时闻即右线虫游出，在解剖镜下用挪或吸管收集綫虫。
此法适用丁分离地上或地下部迁移性内奇尘线虫，如水稻干尖线血（Aph.etenchoilesbesseyi）、菊花钻线出（Aphelenchmides ritzemahnst）穿孔线虫（Radophozus spp.）根腐线虫（Prutytenchus app,）、粒线虫(Anguina spp.)和萃线虫(Ditylerchus spp:)等。8.2.3浅盘法
將样品平效在铺有单层或双层纸巾的筛盘中（图1），筛盆效在装有适量清水的底盘内（水量以刚浸透群品为宜），25℃在右，12h--24h后，蕊去筛盘，将底盘中的线虫悬浮液通过400H的筛了收集绒出。1.层·1样
2.线虫滤纸
图1浅盘法
浅盘法和漏斗法一样，适用于分离植物组织和壤中的线虫。8.2.4贝曼漏斗法
选用直径10cm--16m的漏斗-置于漏斗架上。斗下面套接一段3cm4cm的乳胶管，乳胶管另·端按上小试管，将漏斗注满清水，将十壤样晶或划碎的植物材料用2层～3层纱布或韧性较好的纸.
A.贝曼(Esernann)漏斗法
B.改选型贝受误斗
图2贝曼漏斗法
1.用纱有包熟的样品
3.乳胶性
4.正水夹
了，线虫滤纸或面口红
NY/T12802007
巾包好，轻轻放在漏斗中（图2A），置于25℃左布的室温下，12h~24h后，将线虫悬浮液静止30min60min，充上清液，收集线虫恐浮液约5mL。改进贝受漏斗法又叫浅盘漏斗法（图2B），即将样品放在铺有2层纸巾或纱布的小筛盘中，其他步骤同贝觉谢斗法。小筛盘育径比漏斗直径小2cm--3cm，深度为2 cn,筛眼直择为0.2 cm-0.5 c1。此法适于分离土壤和植物组织中的迁移性线虫，如否燕穿孔线虫（Radlujholus similis）、蹦化叶枯线(Aphelenchoidex riteemnbasz等.8.2.5离心漂浮法
混勺土壤样本；将100cm2土样放人1000mL烧杯或容器内，加水革600mL；搅动20s后，静止60s，上消液经孔径500m和38urm的套网筛，孔径38m网筛置」下方，倾倒过程中，保持网筛倾斜35--40；刀洗瓶冲洗孔径5(X)um网筛。对于胞囊属线虫（HetermxerasPP.）和球胞囊属线虫（Gtabodleruspp.），两筛闻应加一孔径250um的网筛，收案胞囊；从孔径38um的网筛.1=冲洗杂物和线出混物至150ml烧杯内；将冲洗人的混合物倒入离心管内，加高岭上2g3g，3000r/min离心5min；弃上清液，线虫存留于底的残渣沉积物内；再注人蔗糖溶液到离心管内，置电动旋转仪或震离混合器上混勾；1000/nin离心1min，线虫悬浮于薰糖溶液中，取上清燕糖悬浮液，懒人孔释26um网筛上，用洗韬淋洗线出混合样到S0rriL烧怀内，水总体积挤制在20mL较适立：8.2.6淘洗一过筛一贝曼浅盘法
将土壤样品放人淘洗器内，高压强水流冲院，整止305--405，将水感浮液通过孔轻20001m.和38Mn的伴品筛：重复冲洗和过筛3次~4次，从孔径2000m和38pm的筑上分别收集根组织和土壤残留物：将收集的残留物放置」具级巾和文持网的过滤器上；注水没没残留物，补充蒸发掉的水分；置21C～24℃空温下,1d--2d后.收集虫。为获得更多的线虫，收集时间可延长至5d--6d8.2.7过筛法
将土样放人适立容器内，加水淘洗，静山：10s~20后，将忌浮液通过孔径2mn的筛子倒入第一个容器，在第个容器中加人适量清水宣复上述步骤，并用水冲洗筛子，然后将第二个容幕巾的总浮液过0.038mm的筛子，用水充分冲洗筛子←的滤渣，去除土爽题粒，亚将滤渣冲洗到烧杯内，若要收集土壤中的胞攀和线虫卵，第二个容器中的悬浮液要通过由0.25mmm、0.0.38mm和0.028mm的筛子红成的套筛，其0.25mm筛子上收案胞，0.038mm筛子上收集輪虫形线虫，0.028mm筛子.上收集。
此法主要用于分离上溅中线虫，对活动性弱、出体较人的线虫分离效果较好。8.2.8漂浮法
8.2.8.1简易漂浮法
将待分离的十样风十后用手将土粒轻轻镶碎，经6mm孔径筛子过筛底，放人1000ml维形瓶内：加少量水究分揉动使土样湿润，然后边加水边搅动垒呈悬浮液，书加水至掘口处，静盘10min-151ri将漂浮物倒入有滤纸的漏斗内过滤，晾干，用解剖镜检查有无胞囊，用毛笔粘取胞置丁小平血内待鉴定。
该法主要用于分离100g以下十壤中的胞囊。8.2.8.2漂浮器法
该法的漂浮器主要淋洗喷头211--0.85mm的上筛、漏斗，漂浮商和0.2mm-0.147rmm的底筛组成（图3)。分高时，先将漂浮筒加满水，把风干的十样散在孔径4mm的上筛，用强水流冲洗，把全部土样冲洗到漂浮简内，胞囊和草屑等浮在水面川溢出，经环颈水槽流到孔径（.25mm的底筛中，用清水冲洗底筛，并将胞囊淋洗到烧杯中，记烧杯中的漂浮物倒在铺有滤纸的漏斗中过滤，胞魔留在滤纸上。把晾十后的纸放在解剖镜下，用毛笔收集胞尴。此法主蔓用于分离较多上壤胞藜4
「.喷水头
8.3线虫标本的制作和保存
8.3.1线虫的杀死
图3 Fenwich-Onsicnbrik胞囊漂浮器NY/T 12B02007
5.环颈水槽
6.源浮筒
线虫分离后叫直接检查，如果样本需要保存，就需将线虫先热杀死后固定，防止变形变质。一般采用温利热杀死法杀死线凸，即在绒虫总浮液中加人等虽泌水。杀死少最线虫，可以把线出挑（或吸）到载裁玻片上的水滴中，在酒精灯火焰上方来回移动5--6即可。加热时要注意观察，当弯曲的虫休窦然仲直，或呈“（\形及螺旋形时，立即停止加热，或用于背接触玻片，感说稍烫于即可。杀死人量的线虫，可将3ml.-5rL线出悬浮液，置于60℃~65℃的水浴锅处理3mir-5min,其间不断播动小试管，待悬浮液冷却后立即加固定液。
8.3.2线虫的固定
8.3.2.1固定液配制
日前可用的线虫固定液种类较多，可很据线虫种类和现有条件选择使用。一些常用固定液配制方法见附录
8.3.2.2固定
对少量线虫可用挑出针将杀死的线业移到固定液中定和保存，或在含有杀死线虫的水加人等量固定液；大量线虫用“去上清被法固定：线虫悬浮液一沉淀30min一60maim上上清液-加入等量的装度提高1倍的固定液一重复上选步骤2次-3次。8.3.3线虫的保存
将杀死并固定的线虫标本放人盛有线虫保存液的瓶中保存；为了准确鉴定胞囊线虫种，成鉴定2龄幼虫，因此，胞袭不能杀死，确要凝润冷冻保存8.3.4玻片标本的制作
绒虫制片方法因工作性质、研究日的和要求不同而不同，在调查川密度及观察一般形态结将时，常采用临时制片法：为进一步仔细观察或进行分类鉴定，需要经过脱水制成永久玻片并长期保存，8.3.4.1临时玻片标本
以固定为浮载剂或而蒸馏水作浮载剂，如观察时间被长，需要定时补充蒸发掉的水），滴适景于凹戒片上，用挑针将固定好的线虫移数条（般5条一10条）至浮藏剂中，使其下沉，加盖玻片，用指5
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中汕或凡「林时固。待封片剂干后，贴上标签，立邸观察或置」保湿中保存数天至几周。8.3.4.2永久玻片标本
8.3.4.2.1一般方法
8.3.4.2.1.1脱水
a）稀日汕缓慢脱水法
稀H油配制：95%游精8份，甘油1份，硫酸铜少量，蒸馅水91份，混而成。将称甘油倒人表面血，吸人线出，置柜内，防上，室温白然蒸发水分，3周～5周后，将表面而移人干燥器内2d3d，线虫的浮载液即达到无水纯廿油程度，线出体完全脱水，可供制作永久玻片：h）AFG液封法
AFG脱水剂原液配制：95%洒精50份，福尔马林9份，甲醇1份，甘油10份，蒸馅水30份。将AFC脱水剂原液再加水稀释成A液、B液和C液：A液：AFG原液1份，如蒸馏水9份；B液：AFG原液1份，加蒸馏水4份：C液：AFG原液1份，加蒸馅水2份，取表面血，奶人10mIA液，吸取用AFG液保存的线出悬浮液1m，加人表面Ⅲ中，防，室激自然蒸发水分。待A液蒸发掉一半时再加入5mLB液，可在室温中户然蒸发。待B液蒸发掉一乎时，加入2.5mLC液，让其白然蒸发，直率仪剩下甘油为止：8.3.4.2.1.2制片
在载玻片上滴加洁疗纯寸油适量，挑入脱水后的线出，在适当的位置放人3根略比线止粗的坡璃纤维作支撑，上盖玻片，用指甲油或封片胶封片，也可用蜡环法制片，将直径1.5cm的打孔器在泄精灯火焰上加热后，插到蜡盘中蘸取少量石蜡（熔点54），迅遮轻按于载玻片中史，待冷却后即形成蜡阖布蜡圈内滴一小滴纯甘油（用量以盖上盖玻片后不外溢为)作为浮载剂，将已脱水的綫虫5条10条挑人其巾，排列整齐，将略比线出粗的3根玻璃丝均匀置于浮载剂边缘（该法也可不放玻璃丝），加盖玻片店，将载玻片移至6570C的热箱中或电热板上烯蜡，待蜡熔化后移垒实验台上冷却，用指十油或过片胶封片，待指甲汕或封片胶干后恶均次。最后贴上标签，8.3.4.2.2快速方法
8.3.4.2.2.1茶死
准备两个0).5mL的Eppcndof管；向其一管底加人1滴（10L)蒸馏水，并用挑虫针将线虫移到水滴中，将盛有活线电的管放到4℃8℃冰箱中，可保存儿大：另一管加满4%牛醛水溶液，并放在置于95C电热板.上的烧杯中（杯中有水)或放在设置同样温度的PCR反应仪中；取山放在冰箱中的线点管置于室溢下；用移液抢迅速将第一管中的热甲醛溶液加入到盛有活线虫的管中，盖上管盖并择免，避免线出粘在管壁上。
8.3.4.2.2.2固定
将管迅速放进已设定程序的热控制仪上，程序为：95℃，2min;65℃，10min；75℃，10min；85C，10min;95℃，10min；如果尤热控制仪，可用简单的电热板；也可将管放在烧杯的80℃水中，根据线虫的量保持20min-40min（大量线出固定的时问长些）：盾定后放置在案温状态下。8.3.4.2.2.3脱水
当管内温度达到宝温时，摇冕管并将含线虫的溶液倒入另一玻璃容器内，用蒸留水冲洗管壁儿次，冲洗液一同倒人容器内；将线电挑至玻片的凹穴叫，回穴中充满甘油和蒸馏水以1.+20比例混合的混合皴；将凹破片放到70℃的电热板上保持15min一20min，线虫使在水油1；可下加入无水甘油完全猴盖出休；保待电热板温度在75℃~80℃之间将含有线出的凹波片迅速移至室温下3次-5次，然后在电热板「让虫体继续渗入计油，尚看到出体的收缩及变形部分完全恢复时，开始准备水久坡片。8,3,4.2.2.4 制片
将线虫挑到载玻片上石蜡环的纯甘油滴，盖上盖玻片，在80T一85的电热板无加热，直到石蜡6
环融化，封片，最后贴上标签。8.3.4.3根结线虫雌虫会阴花纹的玻片制作NY/T1280—2007
在解镜下从病根内分离出雌虫。选择发育链壮的雌虫若十，移到载玻片上（最好是有机坡片）45%的乳酸中，以锋利小刀切下虫体后端会阴部，用专用细铁挑针或竹针尖端的纤丝仔细别除附在内侧的卵及其他粘连物，并稍加修整，留下需要的角质膜块，将布质膜快移到刃一滴乳酸中，漂洗1次一2次，转移到平净载玻片的纯甘油滴内，表而向上，加盖破片，用时固剂封固边缘，操作应在解剖镜下进行，切下的出体店端定要包含会朗部，在剔除内含物、修整和洗涤时，不能葬破会阴部角质膜。也可用挤压法，将雄出放在载玻片上的水滴中，加盖片，在解剖镜下观察，用钢丝从虫体后端轻压盖玻片（从后端缓慢地向头部方问挤压），使虫体前半部破裂，内脏器官挤出体外。反复挤压几次，挤空体内物质只留下空壳，两层表皮叠合在一起，尼现会阴部的特征，此法操作比较方便，但标本不能长期保存。8.4线虫的形态鉴定
在显微镜下观察线虫标木雌虫、雄虫、幼虫的形态，既观察线虫的活体器官结构，又观察其死态特征；既观察线虫的外部膨态，又观察其内部结构，将观察到的形态结将进行详细描述。观察绒虫各性别的个体数不少于3个重复：必要时，对固定过的线出个体进行数据测量。同一性别的线出个体需测量20条以上，不足20条的全部测量。各线出的形态特征见附录A和附录B。9结果判定
根据线虫的为并症状、形态特征、器官结构、测量数据，按照附录A、附录B皮其他资料，逊行比较、核对、判定，鉴别所检花卉及其他植物是否携带有特定的有害线虫。NY/T 1280-- 2007
A.1茎线虫属
附录A
【规范性附录
花卉植物寄生线虫形态特征
4.1.1腐烂茎线虫（又称马铃薯腐烂线虫、甘碧茎线虫)学名：ityfenchts destructor Thorne,1945。寄主：寄主范国非常，已知的寄主有120多种，受出最重的寄主植物主要是马铃薯、甘薯等块茎、快根作物和一些球茎花卉，如鸢尾属、郁金香、风信了、唐昌蒲、大丽花等.是我国和其他许多国家和地区的检疫危险性线虫，
分布：关国、加拿大、欧洲各国、南美、南非、日本、印度、巴基斯坦、孟加拉国等国，在我国部分地区有时亦可检测到此线虫。
传播：随者麟球坐、块鉴，块概、肉质根等以皮黏谢在这些组织上的土壤传播。症状检查：该线虫足种迁移慢植物内寄牛线虫，主要为害植物地下部尤其是块茎、球茎和块根等。该线虫一股从花卉的基部设染，向上延仲到肉质鳞片处，引起组织灰到黑褐色坏死，腐烂，概部变黑祸叶片生长不良，叶尖变黄。如侵染声尾属、郁金香寻致萃坏死、腐烂，根变黑，叶片生长不良，叶炎变黄(图 B,1、图 B.2).
病理解剖及病原线业形态观察：根据症状，采集可疑植物材料，川贝受漏斗法或浅盘法分离线出，观察线出虫特征（图B.3)，腐烂茎线出成虫小，蝙虫形；侧线6条；中食道球有瓣膜，后食道腺短，背覆盖肠（佣缢缩）。雌虫卵母细胞双列，后阴子宫囊长是阴距的40%98%。雄出交介伞钟到尾部的50%90%：交合刺间腹部弯曲、前部膨大，基部有指状起。雌雄出体形相似.尾圆锥形.尾端钝尖。测计值：
雌山:L=0.69 r~-1.89 mm;a- 18--49; b- 412;c- 14 --20;c =3-5; V= 77 --84; alylet 10 urn-13 pm
雄: 1.=0.63 mm --1.35 rnm;a=24-50; b= 4 --11; -11~21 ;styler -10 μm~12 μn; spicukIcngth - 24 μm~-27 μm
A.1.2鳞球茎茎线虫(又称起绒草茎线虫）学名：Ditytenchusdipsaci(Kihn,1857)Filipjev.1936寄主：寄主范围极广，日前估计达500种之多。危害的主要花卉有百介、永仙、郁金香、风信子、驾尾、蛇鞭菊、石蒜、仙客来、马蹄莲、康乃碟、福禄考、绣球、唐草蒲、孤挺花、姜花、黄姜、朱顶红、秋海棠、银莲花.蒲包花、柱竹香、堆心菊、剪秋岁、珍珠菜、钓钟柳、宽草、美国薄荷、风铃草、烤落米、解代花、月见草、蛾花、一支黄花、不竹、报春花等。分布：主要分布在温带地区，如欧洲人部分，包括俄罗斯、地中海地区、阿尔巴尼亚，南非、阿尔及利亚、肯尼亚，希腊、意大利、荀萄牙、西西里和西班牙，北美洲，澳大利亚，印度、口本等地区传播：侵害宽主的线虫川随种子、繁殖材料、病植物碎片和污染的1壤等起传播。症状检查：为害地上部常引起植物的举、叶、花等膨人、变形，为害茎基部、鳞球萃、块莹、根些等地下部，守致其腐烂或坏死。郁金香受害后，花茎变粗、弯曲，近花的部位产生淡色的病延；花歪斜、失色；叶片变脆，易产生横尚或纵向的裂缝，鳞木栓化（下缩）（图B.4，图B.6)，水仙及风信子被侵染的典型症状是在叶上产生白黄色疮状师人，轻度侵染时，用手指捏若叶片抒过，能感觉到有竖硬的结节；病株的8
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