【商检行业标准(SN)】 栎树猝死病菌检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2080—2008
栋树猝死病菌检疫鉴定方法
Identification of Phytophthora ramorum Werres,De Cock & Man in't Veld2008-04-29发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2008-11-01实施
本标准附录A、附录B、附录C和附录D为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准起草人：吴品珊、严进、廖太林、巫燕本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准SN/T2080—2008
1范围
栎树猝死病菌检疫鉴定方法
本标准规定了植物检疫中树猝死病菌的检疫鉴定方法。SN/T 2080—2008
本标准适用于针对栎树猝死病菌寄主的苗木、原木、树皮、枝条、枝叶等植物部分及其土壤和介质以及木材、木包装和木制品的人境检疫2原理
2.1分类地位
英文名：pathogenof suddenoakdeath，pathogenoframorumleafblight学名：PhytophthoraramorumWerres,DeCock&Manin'tVeld栎树猝死病菌（Phytophthoraramorum），也称多枝疫霉，属真菌界（Fungi），卵菌门（Oomycota）卵菌纲（Oomycetes），腐霉目（Pythiales），腐霉科（Pythiaceae），疫霉属（PhytophthoradeBary）。Phytophthoraramorum可侵染多种林木和花卉植物，造成栎树等树木猝死（SuddenOakDeath，简称SOD），以及杜鹃、荚遂等花卉枝叶枯菱（TwigBlightofRhododendron）。病菌在世界上的分布和寄主植物参见附录A和附录B。2.2鉴定原理
根据栎树猝死病菌在寄主上的为害症状、形态学特性、巢式PCR特异性扩增片段作为鉴定依据。3仪器和用具
3.1仪器
3.1.1生物显微镜，体视显微镜
3.1.2光照生物培养箱。
3.1.3高压灭菌器。
3.1.4高速离心机。
3.1.5PCR扩增仪，电泳仪，凝胶成像仪。3.2用具
3.2.1塑料盒。
3.2.2黑光灯（18W.320nm~380nm）。3.2.3塑料研杆，移液器。
4试剂和培养基
4.1试剂
4.1.1琼脂粉，V8液，胡萝下，杜鹃叶片。4.1.250%匹马霉素，氨青霉素钠盐，利福平钠盐，五氯硝基苯，碳酸钙4.1.3SDS.Tris-HCI，氯化镁，盐酸，EDTA，氢氧化钠，乙酸钠，氯化钾，Tris，CTAB，TBE，无水乙醇，苯酚，溴化乙锭（EB)，三氯甲烷，异丙醇，异戊醇。4.1.4蛋白酶K，Taq聚合酶，dNTP,DNA分子量Marker(100bp）。4.1.5巢式PCR引物Phytol/Phyto4、Phyto2/Phyto3。1
SN/T2080—2008
4.2培养基
4.2.1选择性培养基PARP-V8
50mL过滤后的V8液，17g琼脂，950mL蒸馏水，灭菌后冷却到50℃，加人在50%的匹马霉素0.01g、氨青霉素钠盐0.25g、利福平钠盐0.01g和五氯硝基苯0.05g（可按比例在二甲基亚矾中溶解后加人）。
4.2.2胡萝卜丝培养基CPA
50g胡萝卜切丝，22g琼脂，1000mL蒸馏水，灭菌。4.2.3V8培养基
V8液体100mL，加人2.5g碳酸钙，15g琼脂，蒸馏水900mL，灭菌。5鉴定方法
5.1症状检查
检验苗木时，主要查验枝梢和叶部。杜鹃花等花卉植物症状为叶片上有黑褐色病斑，茎部有凹陷溃疡斑，枝梢和叶常出现枯菱。检验栎树等原木木材时，重点查验溃疡斑。溃疡凹陷或平坦，常有暗红至黑色的粘性流胶渗出，树皮内部组织褪色，坏死区域的边缘有黑环围绕。取有疑似症状的植物的叶、枝、树皮、根等植物部分做分离培养。土壤和裁培介质也是传播病菌的主要途径，检验时收集被携带进境的土壤和栽培介质，做诱集试验。
5.2分离培养和诱集
5.2.1植物组织和木材的分离培养取植物组织或木材上的病健交界处（无明显症状的取靠近地下部的组织）5mm~10mm，0.5%次氯酸钠消毒2min～5min，在选择性培养基PARP-V8和胡萝下丝培养基CPA上，20℃～22℃C黑暗培养1周～2周。如有白色真菌菌落出现，可转人V8培养基上20℃12h光照/12h黑暗培养。5.2.2土壤和栽培介质的诱集
塑料盒中放入土壤或介质，加人2倍体积的无菌双蒸水，将数张健康的杜鹃叶片（国内市场上杜鹃品种即可）流水冲洗干净，滤纸吸干水分，叶面朝上漂放在水上，盖上盒盖，15℃12h光照/12h黑暗培养。3d后开始检查，取有失绿或水浸状斑的叶片，切取病健交界处，在胡萝卜丝培养基20℃22℃黑暗培养1周～2周。
5.3分子生物学鉴定
5.3.1DNA提取
将有疑似症状的植物叶片、枝条、茎，以及分离出的菌丝，按CTAB法提取DNA(参见附录C)。5.3.2巢式PCR检测
P.ramorum首轮PCR特异性引物Phyto1和Phyto4序列分别为5-CATGGCGAGCGCTTCA-3'.5'-GAAGCCGCCAACACAAG-3',第2轮引物Phyto2和Phyto3的序列分别为5'-AAAGCCAAGCCC TGCAC-3'.5-GGTGGATGGGGACGT G-3。两轮PCR的反应体系和反应条件相同，第2轮DNA样品为稀释500倍的首轮PCR产物。25μL的反应体系有样品DNA5uL.10XPCRbuffer2.5μL，25mmol/L氯化镁4μL，10mmol/LdNTPs0.5μL5μmol/LPrimers1.25μL/1.25μL,5U/μLTaq聚合酶0.25μL，双蒸水10.25μL。反应条件为94℃85s-93℃35s.62℃55s、72℃50s，35个循环-72℃10min。在0.5XTBE电泳缓冲液中，1.5%琼脂糖凝胶电泳，5V/cm，0.5%EB染色20min，凝胶成像仪分析结果。
必要时做荧光PCR检测（参见附录D)。2
5.4菌种保藏
SN/T2080—2008
将分离菌接在V8培养基上，待菌落长满后，切成边长1cm小块，放在有无菌水的试管中，封好，室温保存。
6鉴定标准
6.1菌落特征和病菌形态
P.ramorum的生长速度相对较慢，在PARP-V8和CPA上为2mm/d～3mm/d。PARP-V8上的菌落稀薄，菌丝在培养基间生长，珊瑚状，气生菌丝极少：CPA上菌落呈同心环，稍稀疏，气生菌丝不多。V8培养基上生长较好，菌落致密、平铺。P.ramorum在生长3d后开始产生大量的厚垣孢子，分生孢子囊在有光照时可大量生成。
P.ramorum的菌丝多节，高度分枝，弯曲，成树枝状结构，产生孢子囊、厚垣孢子和卵孢子。孢子囊大多为椭圆形、纺锤体形或长卵形，有半乳突，易脱落，无柄或具有短柄，长×宽范围值为（25μm~97μm）×（14μm~34μm），平均24um×52μm，长宽比范围为1.8~2.4，P.ramorum抱子囊较长的特征是它与其他近似种区分的重要特性。厚垣孢子由菌丝端产生，球形，壁薄，在培养基上先为透明，然后发展至浅褐色、褐色，形态很大，直径一般为46.4uμm～60.1μm，最大可达88um，P.ramorum的厚垣孢子大、产生丰盛也是它的主要特征之一。
病菌为异宗配合，卵孢子大小为27.2μm~31.4um。6.2PCR特异性产物
巢式PCR的首轮特异性扩增片段为687bp，第2轮特异性扩增片段为291bp。7结果判定
根据栎树猝死病菌的鉴定标准（见第6章)，对分离菌和核酸提取物进行判定。如分离菌的形态特征或PCR产物与鉴定指标吻合，可鉴定为栎树猝死病菌，否则，不视为栎树猝死病菌。3
SN/T2080—2008
附录A
（资料性附录）
栎树猝死病菌的世界分布
北美洲：美国（加利福尼亚州、俄勒冈州）。欧洲：德国、荷兰、波兰、西班牙、英国、比利时、法国、意大利、丹麦、瑞典、爱尔兰、斯洛文尼亚、芬兰、瑞士、挪威。
Abiesconcolor
Abiesgrandis
Abies magnifica
Acercircinatum
Acerdavidii
Acerlaevigatum
Acermacrophyllum
Acerpseudoplatanus
Adiantumaleuticum
Adiantum jordani
Aesculus californica
Aesculushippocastanum
Arbutus menziesii
Arbutus unedo
Arctostaphyloscolumbiana
Arctostaphylosmanzanita
Arctosta phylos u-ursi
Ardisia japonica
Calluna vulgaris
Calycanthus occidentalis
Camellia spp
Castanea sativd
Castanopsis orthacantha
Ceanothus thyrsiflorus
Cinnamomum camphora
Clintonia andrewsiana
附录B
（资料性附录）
栎树猝死病的主要寄主
Cornus kousa XCornus capitataCorylus cornuta
Distylium myricoides
Drimys winteri
栎树猝死病的主要寄主
英文名
Whitefir
Grand fir
Red fir
Vine maple
Striped bark maple
Evergreen maple
Big leaf maple
Planetree maple
Western maidenhair fern
California maidenhair fern
California buckeye
Horse chestnut
Madrone
Strawberry tree
Manzanita
Manzanita
Kinnikinnick.Bearberry
Ardisia
Spicebush
Camellia
Sweet chestnut
Castanopsis
Blueblossom
Camphor tree
Andrew's clintonia bead lilyCornus Norman haddon
California hazelnut
Myrtle-leafed Distylium
Winter's bark
SN/T2080—2008
中文名
白冷杉
巨冷杉
加州红冷杉
大卫械
欧洲械
铁线蕨
加州铁线蕨
加州七叶树
欧洲七叶树
优材草莓树
草莓树
毛枝熊果
北加州熊果树
紫金牛
欧洲石楠
加州蜡梅
山茶属
欧洲栗
安德鲁七筋姑
四照花
加州榛子
杨梅蚊母树
卤室木
SN/T2080—2008
Dryopleris arguta
Eucalyptus haema'stoma
Euonymuskiautschouicus
Fagus syluatica
Frangula californica (-Rhamnuscalifornica)
Frangula purshiana (-RhamnusPurshiana)
Fraxinus ercelsior
Frarinus latifolia
Garrya elliptica
Gaultheria shallon
Griselinia littoralis
Hamamelis mollis
Hamamelis virginiand
Hamamelis intermedia (H, mollis&H.japonica)
Heteromeles arbutifolia
Ilerpurpurea
Kalmiaspp.
Laurusnobilis
Leucothoe axillaris
Leucothoe fontanesiana
Lithocarpus densiflorus
Lonicera hispidula
Loropetalum chinense
Magnolia grandiflora
Magnolia stellata
MagnoliaX loebneri
MagnoliaXsoulangeana
Mahonia aquifolium
Maianthemum racemosum (=Smi
lacina racemosa)
Manglietia insignis
Michelia doltsopa
Michelia maudiae
表B.1（续）
英文名
California wood fern
Seribbly gum
Spreading euonymus
European beech
California coffeeberry
Cascara
European ash
Oregon ash
Silk tassel tree,Coast silk tasselSalal,Oregonwintergreen
Griselinia
Chinese witchhazel
Witch-hazel
Hybrid witchhazel
Oriental holly
Mountain laurel-all species,hybridsand cultivars
Bay laurel
Dog hobble.Fetterbush
Drooping leucothoe
Tanoak
California honeysuckle
Loropetalum
Southern magnolia
Star magnolia
Loebner magnolia
Saucer magnolia
Oregongrape
False Solomon's seal
Red lotus tree
Michelia
Michelia
中文名
加州木蕨
红口桉
胶东卫矛
紫叶水青冈
加州鼠李
北美鼠李
欧洲白蜡树
阔叶白蜡树
海岸丝穗木
柠檬叶白珠树
滨海山茱黄
金缕梅
美洲金缕梅
戴安娜金缕梅
加州冬青
山月桂属
腋花木藜芦
垂植木藜芦
密花石栎
加州忍冬
荷花玉兰
日本毛木兰
淡玫瑰星花木兰
二乔玉兰
冬青叶十大功劳
舞鹤草
红花木莲
南亚含笑
深山含笑
Michelia wilsoni
Nerium oleander
Nothofagus obliqua
Osmanthus decorus (
decora;P.vilmoriniana)
Osmanthus delavayi
Osmanthus fragrans
Phillyrea
Osmanthus heterophyllus
Osmorhiza berteroi
Parakmeria lotungensis
Parrotia persica
Photinia fraseri
Pieris spp.
Pittosporum undulatum
Prunus laurocerdsus
Prunus Lusitanica
Pseudotsuga menziesii
Pyracantha koidzumii
Quercusacuta
Quercus agrifolia
Quercus cerris
Quercus chrysolepis
Quercus faleata
Quercus iler
Quercuskelloggii
Quercus parvula
Quercus petraea
Quercusrubra
Rhododendron spp.
Rosa (specific cultivars)
Rosa gymnocarpa
Rosa rugosa
Rubus speciabilils
Salir caprea
表B.1（续）
英文名
Michelia
Oleander
Roble beech.Southern beech
Osmanthus
Delavay Osmanthus.Delavay tea oliveSweet olive
Holly olive
Sweet cicely
Eastern joy lotus tree
Persian ironwood
Red tip photinia
Andromeda, Pieris-all species hydrids and cultivar
Victorian box
English laurelcherry laurel
Portuguese laurel cherry
Douglas fir
Formosa firethorn
Japanese evergreen oak
Coast live oak
European turkey oak
Canyon live oak
Southern red oak
Holm oak
California black oak
Shreve oak
Sessile oak
Northern red oak
Rhododendron
Hybrid rose, Royal bonica. Pinkmeidiland,Pink sevillana
Wood rose
Rugosa rose
Salmonberry
Goat willow.Kilmarnock willowSN/T2080—2008
中文名
峨眉含笑
欧洲夹竹桃
歪叶假山毛榉
南桂花
香根芹
拟单性木兰
波斯铁木
红叶石楠
马醉木属
岛海桐花
葡萄牙稠李
花旗松
台湾火棘
日本常绿栎
加州栎
土耳其栋
黄鳞栎
西班牙栎
加州黑栋
希氏栎
无梗花栋
杜鹃花属
粉色美地澜杂交月季
木蔷薇
北美悬钩子
黄花柳
SN/T2080—2008
Schima allichii
Sequoia sempervirens
Syringa vulgaris
Tarus baccata
Taaus brevifolia
TarusXmedia
Torreya californica
Toxicodendron diversilobum
Trientalis latifolia
Umbellularia californica
Vaccinium ovatum
Vancouveria planipetala
Viburnumspp.
表B.1（续）
英文名
Chinese guger tree,NeedlewoodCoast redwood
European yew
Pacific yew
California nutmeg
Poison oak
Western starflower
Californiabaylaurel,PepperwoodOregon myrtle
Evergreen huckleberry
Redwood ivy
All species of viburnum
中文名
峨眉木荷
北美红杉
欧洲丁香
欧洲红豆杉
短叶红豆杉
曼地亚红豆杉
加州框树bZxz.net
西部七瓣莲
加州桂
加州越橘
范库弗草
荚遂属
注：本表来源于2007年8月APHIS List of RegulatedHosts and Plants associated withPhytophthora ramorum。8
附录C
（资料性附录）
DNA提取方法
SN/T2080—2008
样本为植物组织时，将植物组织洗净消毒后切成小块，冷冻加液氮研磨，人1.5mL离心管中待用样本为真菌时，收集菌丝放人1.5mL浸在液氮里的离心管中，用塑料碾碎待用。离心管中加人300μL～500μLCTAB缓冲液（其中含0.1g蛋白酶K）混匀，65℃水浴1h；13000g离心5min～10min，保留上清液；加500μLTris饱和酚：三氯甲烷：异戊醇（体积为25：24：1）混匀，13000g离心5min~10min，保留上清液：再加500μL三氯甲烧：异戊醇（体积为24：1）混匀，13000g离心5min~10min，保留上清液；加人1mL异丙醇混，一70℃下放置1h，或一20℃过夜；13000g离心30min，可见DNA沉淀；70%乙醇洗DNA沉淀，室温干燥；用30μL~50μLTris-EDTA缓冲液溶解DNA，待用。
附录D
（资料性附录）
荧光PCR方法
引物序列为Pram114-FC:5-TCATGGCGAGCGCTGCA-3°,Pram1527-190-R:5'-AGTATATTCAGTATTTAGGAATGGGTTTAAAAAGT-3:TaqMan探针Pram1527-134-T:5-FAMTTCGGGTCTGAGCTAGTAG-TAMRA-3;植物内标引物COX-F:5-CGTCGCATTCCAGATTATCCA-3.COX-RW:5-CAACTACGGATATATAAGRRCCRRAACTG-3;TaqMan内标探针COX-P:5'-VIC-AGGGCATTCCATCCAGCGTAAGCA-TAMRA-3。25μL反应体系有样品DNA1μL,10XPCRbuffer2.5μL，25mmol/L氯化镁1μL,10mmol/LdNTPs1μL,5μmol/LPrimer(Pram114-FC/Pram1527-190-R)2μL/2μL,5μmol/LProbePram1.5μL,5μmol/LPrimer(COX-F/COX-RW)1.5μL/1.5μL,5μmol/LProbeCOX1.5μL,5U/μLTaq聚合酶0.25μL，双蒸水9.25μL。反应循环为94℃10min-94℃15s，60℃60s循环40次。样本为植物组织时,FAMCt值和VICCt值均小于36,可鉴定为栎树猝死病菌。样本为纯菌时，FAMCt值小于36，可鉴定为栎树猝死病菌。9
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