【商检行业标准(SN)】 主要食用菌中转基因成分定性PCR检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2074—2008
主要食用菌中转基因成分定性
PCR检测方法
Protocol of the qualitative polymerase chain reaction(PCR)for detectinggenetically modified component in familiar ediblefungi2008-04-29发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2008-11-01实施
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、本标准主要起草人：陈文炳、邵碧英、江树勋、李寿崧、朱晓南、郭立新、杨婕本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准SN/T2074—2008
1范围
主要食用菌中转基因成分定性
PCR检测方法
本标准规定了主要食用菌中转基因成分检验的抽样、制样、定性PCR检测方法。SN/T2074—2008
本标准适用于对主要食用菌（杏鲍菇、红菇、姬松茸、香菇、草菇、牛肝菌、鸡腿菇、金针菇、双孢蘑菇、猪肚菇、凤尾菇、小平菇、秀珍菇、猴头菇、金顶侧耳、茶树菇、竹荪、黑木耳、白木耳等）中转基因成分的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987）SN/T1204植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法3缩略语
下列缩略语适用于本标准。
SnopalinesynthasegenefromAgrobacteriumtumefaciens来源于根癌农杆菌的胭脂碱合成酶基因。3.2
BARphosphinothricin acetyltransferase gene from Bacillus amylolique faciens来源于杆菌Bacillusamvloliquefaciens草丁麟乙酰转移酶基因3.3
GUS β-glucuronidase gene
β-葡糖醛酸酶基因（作为植物基因表达的报告基因）。3.4
Ineomycin-3'-phosphotransferasegeneNPTI
来自大肠杆菌K12菌株的新霉素-3'-磷酸转移酶Ⅱ基因。3.5
18SrDNA
编码18SrRNA（核糖体）的DNA
4原理
样品经过提取DNA后，针对转基因食用菌所导人的常见外源基因的基因序列设计引物，通过PCR技术，对外源基因的DNA片段进行特异性扩增，根据实验结果，判定该食用菌样品是否含有外源基因成分。
SN/T2074—2008bzxz.net
5试剂和材料
除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T6682规定的一级水。5.12%CTAB缓冲液:20g/LCTAB,0.1mol/LTris-HCI(pH8.0),20mmol/LEDTA(pH8.0)。5.2Tris饱和酚或水饱和酚。
三氯甲烷。
异戊醇。
异丙醇。
无水乙醇。
70%乙醇。
TE溶液(10mmol/LTris，1mmol/LEDTA.pH8.o)。Rnase A(10 μg/mL)。
蛋白酶K（20mg/mL）。
琼脂糖：电泳纯。
三羟甲基氨基甲烷（Tris）。
氯化钠溶液（1.0mol/L)。
EDTA(pH8.0）：乙二胺四乙酸。10XPCR缓冲液（含25mmol/L氯化镁）。dNTPs溶液：dATP,dCTP.dGTP.dTTP各2.5mmol/L。TaqDNA聚合酶。
引物：检测转基因食用菌内、外源基因的引物序列及相关信息见表1。表1PCR引物与PCR产物
基因名称
18SrDNA
基因来源
引物序列
5'-TCT GCC CTA TGAACT TTC GAT GGT A-3'5'-AAT TTG CGC ATT GTG CGT CA-35'-ATC GTT CAAACA TTT GGC A-3'5'-ATT GCG GGA CTC TAA TCA TA-3'5'-ACAAGC ACG GTC AAC TTCC-35'-AAA CCC ACG TCA TGC CAG TTC-35'-GGTCAGTCCCTT ATG TTA CG-3'5'-GTG TAG AGC ATT ACG CTG CG-3\5-AGGCTATTCGGCTATGACTGG-3
5'-GCGGTCCGCCACACCCAGCCG-3'
扩增长
度/bp
退火温
度/℃
终止子
目的基因
报告基因
标记基因
5.19研究转基因食用菌用的阳性质粒p301-bG1,含有终止子NOS、香菇三磷酸甘油醛脱氢酶（GPD）基因启动子、目的基因BAR、报告基因GUS等元件.从中提取DNA溶液。5.20溴化乙锭（EB）：10mg/mL
5.21DNA分子量标准。
5.225×TBE缓冲液：Tris54g.硼酸275g.0.5mol/LEDTA（pH8.0)20mL加蒸馏水至1000mL5.236×加样缓冲液（电泳前沿指示剂）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油水溶液（或40%蓝糖）。
5.24Eppendorf离心管：1.5mL，2mL两种规格，用前须高压灭菌处理。5.25PCR反应管：200uL，用前须高压灭菌处理。6仪器设备
研钵或电动研磨器
6.2恒温水浴锅或干式恒温器：恒温范围为室温～100℃，精度为士0.5℃。6.3
电子天平：感量为0.001g与0.0001g。台式高速离心机，低温冷冻高速离心机，小型瞬时离心机。6.4
5高温干燥箱。
冷冻、冷藏冰箱。
制冰机。
旋涡振荡器。
6.9高压灭菌锅。
6.10pH计。
SN/T2074—2008
6.11微量移液器：体积范围为0.20μL~2.0μL,2μL~20μL，20μ~200μL，200μL~1000μL，枪头用前应高压灭菌处理。
2DNA浓缩仪。
6.13核酸蛋白分析仪。
6.14纯水机。
6.15PCR超净工作台或生物安全柜。6.16PCR仪。
6.17微波炉。
6.18电泳仪。
6.19电泳槽。
凝胶分析成像系统。
7测定方法
7.1DNA的抽提及浓度测定
7.1.1DNA的提取
称取约50g烘干后的食用菌样品，经干热灭菌（150℃C干热处理2h）或120℃.30min高压消毒处理的研钵或在粉碎机中研磨成颗粒大小约0.5mm左右的粉末，备用。称取100mg烘干后研磨成粉的样品于1.5mL的离心管中，加600μL2%CTAB缓冲液，5μL蛋白酶K（20mg/mL），5μLRnaseA（10μg/mL），剧烈振荡30s以上，65℃温浴1h，期间定期振荡。加600μL水饱和酚：三氯甲烷异戊醇（25：24：1），剧烈振荡，1.2×10g离心15min。取上清液，再加等体积的水饱和酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1），振荡混匀，1.2×10g离心15min。取上清液.加0.8倍体积异丙醇，混匀.1.2×10*g离心10min。取沉淀，加入400μL氯化钠（1mol/L）于65℃温浴中溶解，加等体积的水饱和酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）振荡，1.2×10°g离心15min。取上清液，加2倍体积的无水乙醇，轻微振荡，1.2×10*g离心10min。取沉淀，70%乙醇清洗2次，干燥，加100μLTE（pH8.0）溶解。每个样品设2个重复。也可使用市售的应用于真菌DNA提取的试剂盒。7.1.2DNA的浓度与纯度测定
7.1.2.1方法1
样品DNA用核酸蛋白分析仪测定260nm和280nm处吸收值，分别计算DNA纯度与浓度.DNA纯度等于ODz60/OD20.比值在1.7~2.0之间较为理想。双链DNA浓度（μg/mL）等于50倍OD26值。SN/T2074—2008
7.1.2.2方法2
通过真核生物共有的核糖体18SrDNA基因的PCR扩增结果，判定从样品中提取的DNA是否适合于PCR检测，PCR测试步骤按7.2规定的方法。7.2定性PCR检测
7.2.1PCR反应体系
检测食用菌中的内源18SrDNA基因与外源基因采用的PCR检测体系见表2。每个样品反应体系设2个重复（同时做2管）。
表2定性PCR检测参考反应体系
试剂名称
10×PCR缓冲液（含
25mmol/L氯化镁）
Tag酶
正向引物
反向引物
DNA模板
双蒸水(ddH.O)
储备液浓度
2.5mmol/L
5U/μL
10μmol/L
100ng/μL~2000ng/μL
7.2.2PCR反应体系对照的设置
25反应体系
加样量/μL
补至25
进行PCR检测时设立置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照：转基因食用菌的阳性质粒或转基因食用菌中提取的DNA。阴性对照：非转基因食用菌中提取的DNA空白对照：用配制反应体系的实验用水代替模板。7.2.3PCR反应热循环参数的设置50uL反应体系
加样量/μL
补至50
94℃预变性2min。94℃变性30s.54℃退火40s，72℃延伸1min，40个循环。72℃延伸5min。4℃下保存。也可根据不同的基因扩增仪对PCR反应热循环参数做相应的调整。7.2.4PCR扩增产物的电泳检测
用0.5×TBE电泳缓冲液制备2%的琼脂糖凝胶。将8uL～10μL的PCR扩增产物分别与1uL～2μL的6×加样缓冲液（电泳前沿指示剂)混合后，在凝胶板上的孔中点样。用分子量大小适当的DNAMarker做分子量标记。选择合适的电压（3V/cm～5V/cm），电泳时间为50min～60min。用凝胶成像仪观察、拍照、记录与分析。8结果判断
8.1样品DNA抽提质量判断
按照真核生物共有的核糖体18SrDNA基因的序列设计的引物，对食用菌阴性样品与待测样品的DNA提取液进行PCR扩增。均应扩增出137bp的片段，否则，说明提取的DNA质量有问题，或者是DNA溶液中存在PCR反应的抑制因子应该重新纯化或提取DNA，直至扩增出该DNA片段.防止检测中产生假阴性结果。
8.2外源基因的检测
如果阴性对照与空白对照未扩增出DNA片段，阳性对照扩出预期的DNA片段，待测样品未扩增出预期的DNA片段，可以断定待测样品中不含有外源基因，如果扩出预期的DNA片段，则可初步判定A
待测样品中含有可疑的外源基因，应进一步进行确证实验。8.3结果确证实验与结果表述
8.3.1方法1实时荧光PCR检测方法待测样品外源基因PCR扩增阳性结果的，按照SN/T1204中规定的方法执行。8.3.2方法2PCR扩增产物的DNA测序方法SN/T2074—2008
外源基因PCR扩增阳性结果的，可委托有资质的生物技术公司对扩增产物进行测序，所获得的序列与已知的该外源基因相应序列进行比对加以确证。注：可根据实验室条件任选一种方法进行确证。8.3.3结果表述
经8.3.1或8.3.2确证为阳性的，表述为：检出××××基因；确证为阴性的，表述为：未检出XXXX基因。
样品保存
9.1保存条件
干燥样品保存在常温下，新鲜样品保存于一20℃下。9.2保存期限
保存期限为3个月。
SN/T2074-2008
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
主要食用菌中转基因成分定性
PCR检测方法
SN/T20742008
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16
2008年7月第一版
印张0.75
字数10千字
2008年7月第一次印刷
印数1—2000
书号：155066·2-18945
定价8.00元
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