【商检行业标准(SN)】 亚洲柑橘黄龙病菌检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2071—2008
亚洲柑桔黄龙病菌检疫鉴定方法Identification of Candidatus liberobacter asiaticum2008-04-29发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2008-11-01实施
本标准的附录A为资料性附录。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T2071—2008
本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中国检验检疫科学院动植物检疫实验所。
本标准主要起草人：李今中、王念武、周卫川、朱水芳、林阳武，本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准I
1范围
亚洲柑桔黄龙病菌检疫鉴定方法本标准规定了进出境植物检疫中亚洲柑桔黄龙病菌的检疫和鉴定方法。SN/T2071—2008
本标准适用于进出境柑桔种子、苗木等寄主繁殖材料和柑桔水果类等植物产品中亚洲柑桔黄龙病菌的检疫和鉴定。
2原理
2.1亚洲柑桔黄龙病菌分类地位
亚洲柑桔黄龙病菌（Candidatusliberobacterasiaticum）属于薄壁菌门（Gracilicutes）韧皮部杆菌属（Liberobacter）亚洲型细菌。相关资料参见附录A。2.2检疫鉴定原理
利用多聚酶链式反应（polymerasechainreaction)技术，进行亚洲柑桔黄龙病的检疫鉴定。PCR产物进行测序和BLAST，用于区分亚洲柑桔黄龙病菌和其他两种柑桔黄龙病菌3仪器
3.1研体。
3.2白瓷盘。
3.3pH计。
PCR管、Eppendorf管(1.5mL）。3.4
移液枪（1000μ可调、200μ可调、20μ可调、2.5μ可调）。3.6
恒温水浴锅或恒温培养箱。
分析电子天平。
低温冷冻超速离心机、低速离心机。3.9
PCR扩增仪
电泳仪。
凝胶成像仪。
低温冰箱。
高压灭菌锅。
超净工作台。
4试剂药品
4.1 50mmol/L的Tris-HCl。
10mmol/LEDTA(pH8.0)
4.30.2mol/L氢氧化钠+1%SDS。
4.40.5mL的乙酸钠（pH4.8)。
液氮。
无水乙醇、双蒸水（DDW）。
引物。
10XPCR缓冲液、Taq多聚酶。
SN/T2071—2008
4.9dNTP,Marker。
4.101.2%琼脂凝胶、EB。
4.11DNA纯化试剂盒
5亚洲柑桔黄龙病（Candidatusliberobacterasiaticum）的检测和鉴定5.1检验样品的准备
症状检查：症状复杂，易与生理病害混淆，其典型症状为黄梢和斑驳。发病初期，病树部分新梢叶片不转绿而呈均匀黄化；叶片从主、侧脉附近或叶片基部边缘出现黄绿相同的斑驳，后期叶片均匀黄化、失去光泽，叶脉柄肿大，木栓化，硬脆而易脱落果实小而呈畸形检测样品：从待检样品中挑取有疑似症状的柑桔叶片叶脉约0.05g～0.1g，用无菌水冲洗净。阳性对照：取感病的柑桔叶脉0.05g～0.1g，用无菌水冲洗净阴性对照：取健康的柑桔叶脉0.05g～0.1g·用无菌水冲洗净。5.2样品DNA提取
将准备好的样品和阳性对照样品各0.05g～0.1g，剪碎后分置于研钵内，加液氮研磨成粉末，再加人50mmol/L的Tris-HCl.10mmol/LEDTA(pH8.0)各0.4mL,14000r/min离心5min，取上清液0.5mL.加入等体积0.2mol/L的氢氧化钠十1%SDS，摇勾，冰浴10min，再加人0.5mL的乙酸钠（pH4.8），摇匀，冰浴5min，14000r/min离心5min，取上清液0.5mL，加人1mL的无水乙醇，在一20℃下放置2h，15000r/min离心15min，沉淀用75%乙醇洗2次，吹干，灭菌双蒸水DDW溶解。注：如果采用市场所售的植物总DNA试剂盒提取，则按其公司提供的方法提取DNA5.3PCR扩增
5.3.1扩增引物
上游引物P1：5-AGCGTTGTTCGGAATAACTGG-3下游引物P2：5-ACCTTCCTCCGGCTTATCAC-3PCR预期产物DNA片断长度为654bp。5.3.2PCR扩增
用大约1.0μg~3.0μg的DNA模板，10×PCR缓冲液、各成分的终浓度为：200μmol/LdNTP、1.25~2.5UTaq多聚酶、镁离子1mmol/L~4mmol/L、引物Pl和引物P2各0.5μmol/L~1μmol/L，反应体积为50uL，混合后在PCR仪上进行扩增，柑桔感病叶脉样品做阳性对照，健康叶脉样品做阴性对照，超纯水做空白对照。扩增程序为：94℃变性5min后，每一个PCR循环温度、时间分别是94℃、45s，55℃、45s.72℃、50s，进行35个循环，72℃延伸10min。注：反应体系的参数和扩增条件可根据自己购买的Taq多聚酶设置5.3.3琼脂凝胶电泳
用1.2%琼脂凝胶进行电泳，EB染色，凝胶成像系统观察、拍照。5.3.4PCR结果判定
电泳成像结果，如果阳性对照样品和待测样品均出现大约654bp的预期条带，而阴性对照样品无预期条带，则判定检测结果为阳性：阳性对照样品出现预期条带而阴性对照和待测样品均无预期条带，则判定检测结果为阴性
5.4：PCR扩增产物的测序和BLAST（局部相似性基本查询工具）5.4.1PCR扩增产物纯化
PCR合成产物用DNA纯化试剂盒进行纯化，每一扩增产物（25uL）加人1mLWash溶液，以15000r/min速度离心30s后，在室温下孵育5min，15000r/min离心5s.弃上清液，再加人1mLWash溶液，重复1次前面的步骤，移去上清液后，风干蒸发残余的洗涤液，风干后加入20uL无菌DDW溶解。
5.4.2PCR扩增产物测序
将纯化的PCR产物进行测序。
5.4.3BLAST同源性比较
SN/T2071—2008
将扩增产物测序结果在GenBank中进行BLAST比对，比较PCR产物与三种柑桔黄龙病的同源性。
5.4.4BLSAT结果判定
如果扩增产物与亚洲柑桔黄龙病菌同源性达到97%以上，则判定为亚洲柑桔黄龙病菌，否则判定不是亚洲柑桔黄龙病。
结果评定
PCR反应结果为阳性，测序结果经BLAST后与亚洲柑桔黄龙病菌同源性达到97%以上则判定为亚洲柑桔黄龙病菌；否则判定测试样品不含亚洲柑桔黄龙病菌。7样品的保存和复核
样品保存6个月，发现亚洲柑桔黄龙病的样品保存1年。柑桔种苗在隔离室盆栽保存，若为果实则保留经液氮干燥后的果蒂在一20℃条件下保存，若是叶片同果实保存方法。检测的原始记录、照片、文档按有关规定做好登记、标识和存档，以备必要时复核。SN/T2071—2008
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（资料性附录）
亚洲柑桔黄龙病菌简介
业洲柑桔黄龙病菌（Candidatusliberobacterasiaticum）为薄壁菌门韧皮部杆菌属（Liberobacter）细菌，是一种无法人工纯培养杆菌。在电镜下看到其形态多为椭圆形或短杆状，大小为（30nm～600nm）×（500nm~1400nm），细胞壁厚度为25nm～30nm，革兰氏染色阴性，对四环素族抗菌素及青霉素敏感。病原可以通过嫁接或荧丝子（Cuscutacompestris）传播，但不能通过汁液和土壤传播，自然传播介体为亚洲木虱（Diaphorinacitri）。相似的病原细菌还有两个株系：即非洲型（Candidatusliberobacterafricanum），传播介体为非洲木虱（Triozaaryteae）以及最近在巴西发现的美洲型（Candidatusliberobacteramericanum)
亚洲柑桔黄龙病是柑桔上的一种毁灭性细菌病害，主要分布于非洲的毛里求斯、留尼旺岛（法属），亚洲的日本、印度、孟加拉国、巴基斯坦、泰国、越南、东南亚诸国，以及我国广东、香港、广西、福建、台湾、海南、云南、贵州、四川、浙江、湖南、江西等地。寄主植物主要有：桔橙、柠檬、柚、四季秸、柑、茶枝柑、甜橙等。该病被认为是世界上最危险的植物病害之一，严重威胁柑桔属水果生产。柑桔感染该病后，可致畸形、树势衰弱、果实苦。发病相桔树一般在3年～5年内丧失结果能力，直至枯死，严重时甚至毁灭整个柑桔园。国际上许多国家和地区对该病实施检疫，我国已将该病列人新增的进境植物检疫危险性有害生物名单。
症状检查：症状复杂，易与生理病害混淆。其典型症状为黄梢和斑驳。发病初期，病树部分新梢叶片不转绿而呈均匀黄化；叶片从主、侧脉附近或叶片基部边缘出现黄绿相同的斑驳，后期叶片均匀黄化、失去光泽，叶脉柄肿大，木栓化，硬脆而易脱落；果实小而呈畸形。书号：155066·2-18942
SN/T 2071-2008
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