【国家标准(GB)】 粮油检验 谷物及其制品中α-淀粉酶活性的测定 比色法

ICS67.040
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GB/T 5521--2008
代替GB/T5521--1989
粮油检验
谷物及其制品中α-淀粉酶
活性的测定
比色法
Inspection of grain and oils--Determination of alpha-amylaseactivity in cereal and cereal products--Colorimelric method2008-11-04发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-01-01实施
GB/T 5521—2008
本标准是对GB/T5521·1989谷物和谷物产品α-淀粉酶活性的测定比色法》的修订。本标准代替GB/T5521-1989。
本标雅与GB/T55211989相比主要变化如下：一增加了规范性引用文件：
对术语和定义进行了修改；
增加了对测试报告的要求；
将计算举例由正文调至附录，作为资料性附录。本标准的附录A为资料性附录，
本标准由国家粮食局提出。
本标准由全国粮油标准化技术委员会归口。本标准起草单位：南京财经大学。本标准主要起草人：鞠兴荣、王素雅、衰建、杨慧葬本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-GB/T55211985,GB/T5521—1989。http:/
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1范围
粮油检验谷物及其制品中α-淀粉酶活性的测定比色法
GB/T 5521—2008
本标准规定广比色法测定谷物及制品中α-淀粉酶活性的术语和定义、原理、试剂和材料、仪器、操作步骤、结果计算、精密度和测试报告。本标准适用于测定谷物和谷物产品α-淀粉酶活性，也可用于测定源于真菌和细菌的α-淀粉酶干粉的活性。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标摊的条款。凡是注日期的用文件，其随后所有的修改单(不包括断误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的用文件，其最新版本适用于本标准，GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO）3596：1987，MOD）3术语和定义
下列术谱与定义适用于本标准。3. 1
p-极限糊精β-limit dextrins
能被β-淀粉酶完全降解的淀粉产物。3.2
酶活力单位enzymicactivity
1I溶剂从1样品中所提取的酶，在规定条件下，每秒钟降解1.024×10-5单位的-极限糊精底物溶液，该样品的α-淀粉酶活力为1个单位。4原理
-淀粉酶降解极限糊精底物挤液，在酶促反应进程中，分别在不同时间将反成混合物等分地到摊溶寇中。随着反应时间的延长，反庭混合物与碘液的显色强度降低以测定酶活性，5试剂和材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682中三级水的要求。5.1 碘。
5.2碘化钾。
5.3氯化钙。
5.4无水乙酸钠。
5.5硫酸。
5. 6 冰乙酸
5.7可溶性淀粉。
注：可采用I.intner淀粉或质量相当的国产可落性淀粉。品伙伴网h
GB/T5521—2008
5.8浮石粉。
5.9碘贮备液：称取11.0g碘化钾溶于少量水中，加5.50多结品碘，搅拌至碘完全辫解。再定穿至250 rml.，置丁棕色瓶中，在暗处贮存，此溶液可保存一个月。5.10碘稀释液：称取40.0g碘化钾溶于水中，加4.00mL碘贮备液，并稀释至1L，用时现配，不可过夜。
5.11硫酸溶液：c(H.SO）0.05mol/L5.12缓冲液：称取161g无水乙酸钠溶于水中，加人120mI.冰乙酸，用水定容至1J.。5.13氯化钙溶液：c(CaCl2)=0.2%5.142-淀粉酶溶液：称取10有酶活性的黄豆粉（粗细度为通过1.5mm孔筛），加人85mL水和15mL0.05mal/L硫酸(5.11)充分搅句，静置15min，抽滤，该滤液即为β淀粉酶溶液5.15β-极限糊精溶液：称取5.00g（干基）可溶性淀粉于小烧杯中，加入约20mL水混匀，将其边搅拌边缓慢倒入盛有100mL沸水的500mL高型烧杯(6.6)中，并用洗瓶将小烧杯中的淀粉全部转移至高型烧杯中，继续搅拌并加热，缓慢煮沸2min。加盖表面，在自来水中冷却至30C以下，加人25mL缓冲溶液（5.12)及50mLβ-淀粉酶溶液（5.11)，在室温下放置20h，人1勺浮石粉，将此溶液在10min之内缓慢煮沸，然后继续沸腾5min以上。冷却至30℃以下，用水定容至250mL，摇勾，过滤。滤液中删儿滴甲苯,此溶液的pH值应为(4.7±0.1),在25℃以下可连续使用5天。6仪器
恒温水浴：30℃±0.1℃与20℃±0.1℃各1台。分光光度计或比色计。
秒表。
筛:孔径为1. 0 mm、1. 5 mm。
6.5 pH计。
烧杯及高型烧杯：100tmL，250mL.500mL。6.7
睿量瓶:250 mL,1 000 mL。
锥形瓶,300 ml..
移液管;5 mL.20 mL.
6.10分析天平：分度值0.01g。
7操作步骤
7.1分光光度计及其空白调整
将分光光度计（6.2)连接稳压电源，预热20min，调整波长为575nm。将2.0mL氯化钙溶液(5.13)加到10.0mI.碘稀释液（.10)中，然后以适罩的水(V，）稀释（加水量般为20mL～40mL,V详见7.2)，混勾后置于20℃水浴中，用1cm比色血进行测试，调节仪器狭缝宽度，使吸光度为零。7.2底物溶液的校准
分别吸取5.0mLβ极限糊精溶液（5.15)和15.0mL氯化钙溶液（5.13）于一个100mL烧杯（6.6）中，混句。取出2.0tmL混合液至另一个100ml.烧杯（6.6)中，加入10.0mL碘稀释液(5.10)和适量的水，混勾后置于20℃水浴中，用1cm比色血在波长575nm处，以7.1所用溶液为参比，测其吸光度。谢整加水量，使测得的吸光度在0.55～0.60之间，如果测得吸光度大于0.60则增大加水量，如果测得值少于0.55则减少加水量。通过反复试配，直至测定的吸光度值在0.55~0.60之间，记下此时的加水量(V。），并用它调整空白溶的加水量，V。即为该&极限糊精测试时的加水量。7.3提取
称取谷物样品约5g（精确到0.05g），倒人300rLL锥形瓶中，加入预热到30℃的氟化钙溶液2
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（5.13)100mL±0.5mL,充分播勾，置于30C的恒温水浴中，在15min、30min、45tmin时从水浴中瑕出，上下颠倒锥形瓶（6.8)10次，重新置于水浴，共提取60mi。取出锥形瓶并过滤，滤液即为α-淀粉酶的提取液。
7.4活性测定
将a淀粉酶提取液和α极限糊精溶液置于30℃水浴中预热，10min后用快速移液管吸移5.0mlβ-极限糊精溶液(5.15)至盛有15.0mL酶提取液(7.3)的锥形瓶巾，加塞后摇勾。在加液的同时，用秒表计时。吸取10.0mL稀碘溶液（5.10)下各个50mL容量瓶(6.7)中，入V。mL水（7.2).混匀加塞后置于20℃水浴中，每隔5min或10min进行'F列操作：吸取2.0mL酶、P极限糊精混合液(7.4)到一个盛有稀碘溶液和V.mL水的容量瓶中，摇勾a）
后置于20℃水浴中，使混合溶液温度达到20℃；b）倒人比色血测其吸光度。
8结果计算
试样的α-淀粉酶活性按式(1)计算：500xf
式中：
D、D,
9精密度
100—弄
-α-淀粉酶活性，以U(单位)计； lgD,- IgDz=
500 × f × b
tr tz
100ml.氯化钙提取的试样质量，单位为克（g）；试样中水分含量(以质量分数计）)，%；酶提取液的稀释倍数；
不同的反应时间，单位为分（min)；时间、t时的吸光度；
IgD对t曲线的斜率的绝对值；
系数。
同一样试样，在同实验室同时或连续两次测定结果之差，不得超过平均值的10%，如果两次测定结果符合要求，则取结果的平均值。按表1修约表1结果表示方式
活性/U(单位）
50~500
5005000
5000~-50000
修约成兼数范围/U(单位)
注1：测定过程中应合理谢整酶的浓度，使35%~60%的β极限糊精在15min内降解，即最后测得的吸光度为底物校准时吸光度的40%--65%。如果吸光度降得太快，则酸液可用0.2%的氧化钙游液再稀释。如酶的活性太低，为获得正确结巢，可将反应时间延长到心o min以上。注2：用分光光度计测定吸光度时,溶液温度对结果有影响，必须控温在 20℃。在7. 4的操作巾，从显色到测定吸光度的间隔时间一般对结果没有影响，如测定·-系列样品，可在所有样品均完成显色后再一起测定吸光度。但最长间隔时问不得超过1 h.
10测试报告
测试报告应详细说明：
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包括鉴定样品所必需的全部信息；一若已知采样方法，则注明；
-本标准中没有具体说明的、或者被认为是可选的，以及所有可能影响实验结果的操作细节；所的测定结果；
一如进行了重复性试验，列出结果，http://foodmate.net附录A
（资料性附录）
计算举例
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含14.2%水分的样品5.20g，用100mL氯化钙溶液（5.13）提取。出于酶提取液与极限糊精的反应速度太快，故用氯化钙溶液稀释酶提取液，1份酶提取液（7.3)加1.5份氯化钙溶液（5.13）。因此f=1+:1.5-2.5。β极限糊精与悔提取液混合后，间5min、10min和20min后，吸光度分别如表A.1所示：
不同反应时间后的吸光度
时间/tnin
根据5min和10mit后的观察结果：5= 0. 697-0. 628
10—5
—0. 0138 min-
把=0.0138代人武(1)得：
4=500×2.5×0. 013 8/
吸光度D
X100--14. 2-3. 9 U
如用三个观察结果作1gD十1对的曲线（见图A.1），得6=0.0139。Ig1
=-0. 013 9+ 0. 766 5
http:
rungfood
时间/min
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pruducts
参考文献
Method for dctcrmination of alpha*uinylase artivity in cereal and ccreal1S0 3983: 1977
Calorimetric method.
GB/T5521--1989谷物和谷物产品α-淀粉活性的测定比色法，GB/T66821992分析实验室用水规格和试验方法GB/T601化学试剂标准滴定溶液的制备。L47
「51GB/T1.1·2000标准化T.作导则第1部分：标准的结构和编写规则GB/T20001.42001标准编写规则第4部分：化学分析方法[6]
1S057251:1994Accuracy (truerness andprccision)of measuremcnt tethods andIesults-Part l: Gcncral principles and definitions.[8] ISO 5725-2:1991 Accuracy(trueness and prccision)of measurcmcnt methods und resultsPatt 2: 1asic mcthod for the determination of repeatability and rcproducibility ol a standard measurement method.
bt
GB/T 5521-2008
中华人民共和国
国家标推
粮油检验谷物及其制品中α-淀粉酶活性的测定比色法
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