【国家标准(GB)】 饲料中维生素B1测定方法

中华人民共和国国家标准
饲料中维生素B测定方法
Method for the determination of vitamin B, in feeds1主题内容与适用范围
本标准规定了饲料中维生素B，的测定方法。GB/T 14700—93
本标准适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、维生素预混料中维生素B，的测定。萃取液的浓度范围为0.02～0.2μg/mI（在有吸附硫胺素或影响硫色素荧光干扰物质的情况下，本标准不适用）。2引用标准
GB6682实验室用水规格
3方法原理
试样中的维生素B,（即硫胺素C12Hi,ON,SCI)经稀酸消化、酶分解、吸附剂的吸附分离提纯后，在碱性条件下被铁鼠化钾氧化生成荧光色素一一硫色素，用正丁醇萃取。硫色素在正丁醇中的荧光强度与试样中维生素B的含量成正比，依此进行定量测定。4试剂和溶液
除特殊规定外.本标准所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或相应纯度的水。4.1盐酸溶液，0.1mol/L将8.5mL盐酸（GB622)用水稀释至1000mL。4.2硫酸溶液，0.05mol/lL：将2.8mL浓硫酸(GB625)加入水中，稀释至1000mL。4.3乙酸钠溶液2.0mol/L：取164g无水乙酸钠(GB694)或272g结晶乙酸钠（CH2COONa*3H.OGB693)溶于水，稀释至1000mL。4.4淀粉酶悬浮液.100g/L：用2.0mol/L乙酸钠溶液（4.3)悬浮10g淀粉酶制剂（Takadiastase，或相当活性的其他磷酸酯酶），稀释至100mL，使用当日制备。4.5氯化钾（GB646）溶液，250g/L。4.6酸性氯化钾溶液：将8.5mL浓盐酸加入至氯化钾溶液（4.5)中，并稀释至1000mL。氢氧化钠（GB629）溶液，150g/L。4.7
4.8铁鼠化钾（GB644)溶液，10g/L。4.9碱性铁氰化钾溶液：4.0mL的铁氰化钾溶液（4.8)与氢氧化钠溶液（4.7)混合使之成100mL，此液4h内使用。
4.10冰乙酸（GB676)溶液，30mL/L。4.11人造沸石（Q/HG12--445—63，60～80目）使用前必需活化，方法如下：将适量人造沸石置于大烧杯中，加入10倍容积的热乙酸溶液（4.10），用玻璃棒均匀搅动10min，使沸石在乙酸溶液中悬浮，待沸石沉降后，弃去上层乙酸液。重复上述操作两次。换用5倍其容积的热氟化钾溶液（4.5）搅动清洗两次，每次15min。再用热乙酸溶液洗10min。最后用热蒸馏水清洗沸石至国家技术监督局1993-11-06批准200
1994-06-01实施
GB/T 14700—93
无氟离子（用10g/L硝酸银水溶液检验）。用布氏漏斗抽滤，100C烘十，贮于磨口瓶中备用。使用前，检查沸石对硫胺素标准溶液的回收率，如达不到92%，需重新活化沸石。4.12硫胺素标准溶液
4.12.1硫胺素贮备液1：盐酸硫胺素纯品（中国药典参照标准），于五氧化二磷干燥器中干燥24h，称取0.0500g，溶解于pH3.5~～4.3的20%（V/V）乙醇溶液中并定容至500mL，盛于棕色瓶中低温保存。
该溶液每毫升含0.1 mg硫胺素。4.12.2硫胺素贮备液Ⅱ：取硫胺素贮备液1（4.12.1)10mL用酸性20%乙醇溶液定容至100ml.，盛于棕色瓶中低温保存。
该溶液每毫升中含10μg硫胺素。4.12.3硫胺素标准工作液：取贮备液I（4.12.2)2mL与65mL盐酸溶液（4.1）和5ml乙酸钠溶液（4.3）混合，用水定容至100mL。现用现配。该溶液每毫升中含0.2μg硫胺素。4.13硫酸奎宁（Q/HG22—797-68)溶液4.13.1硫酸奎宁贮备液：称取硫酸奎宁0.1000g，用0.05mol/L硫酸（4.2)溶解并定容至1000ml，贮于棕色瓶中低温保存。若溶液混浊则需重新配制。该溶液每毫升中含0.1mg硫酸奎宁。4.13.2硫酸奎宁工作液：取贮备液（4.13.1）3mL.用0.05mol/L硫酸定容至1000ml，盛于棕色瓶中，低温保荐，
该溶液每毫升中含0.3μg硫酸奎宁。4.14正丁醇（HG3-1012），其荧光强度不超过硫酸奎宁工作液的4%，否则需用全玻璃蒸馏器重蒸馏，取114~~118C馏份。
4.15无水硫酸钠（HG3--123）。5仪器、设备
5.1荧光分光光度计，备1cm石英比色杯。5.2电热恒温水浴。
5.3电热恒温箱。
5.4实验室用样品粉碎机。
5.5分析天平：感量0.0001g。
5.6注射器：10ml。
5.7吸附分离柱：全长235mm，外径×长度如下：上端贮液槽容量约为50mL，35mm×70mm；中部吸附管8mm×130mm；下端35mm拉成毛细管。
5.8反应瓶：具塞离心管25mL。
6试样的制备
选取有代表性的饲料样品，至少500g，四分法缩减至100g，磨碎，过0.28mm孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。7分析步骤
7.1称样：称取单---饲料、配合饲料或浓缩饲料1~2g（约含硫胺素420ug），精确至0.001g。维生素预混料0.25~~0.5g，精确至0.0001g，置于100mL容量瓶中。201
7.2提取　
GB/T14700-93www.bzxz.net
7.2.1水解：将0.1mol/L盐酸（4.1)65mL加入试样瓶（7.1)中，经沸水浴加热30min，开始加热5~10min内不时摇动容量瓶，以防结块。或于121～123℃15磅高压釜中加热30min。7.2.2酶解：冷却容量瓶至50℃以下，加5mL淀粉酶悬浮液（4.4），摇匀。该试液的pH约为4.0~4.5，将容量瓶于45～50C恒温箱中保温3h，取出冷却调整pH3.5，用水稀释至100mL。7.2.3过滤：将试液通过无灰滤纸过滤弃去初滤液5mL，收集滤液于锥形瓶中。预混料提取液需逐级稀释，使之含硫胺素约为0.2uμg/mL。7.3提纯
7.3.1制备吸附柱：取1.5g活化人造沸石（4.11）置于50mL小烧杯中，加入3%乙酸溶液（4.10）浸泡。将脱脂棉置于吸附柱底部，用玻璃棒轻压。然后将乙酸浸泡的沸石全部洗入柱中（勿使吸附柱脱水），过柱流速≤1mL/min为宜。再用10mL近沸的水洗柱一次。7.3.2吸25ml提取液（7.2.3），慢慢加入制备好的吸附柱中，弃去滤液，用每份5mL近沸的水洗柱三次，奔去洗液。
7.3.3用25mL60~70℃C酸性氯化钾（4:6)分三次连续加入吸附柱，收集洗脱液于25mL容量瓶中，冷却后用酸性氯化钾定容，混匀。7.3.4同时用25mL硫胺素标准工作液（4.12.3）。重复7.3.1~7.3.3操作，作为外标。7.4氧化与萃取（以下操作避免紫外光照射）7.4.1于两只反应管中各吸入5mL洗脱液（7.3.3），记作A、B。7.4.2向B管加3mL氢氧化钠溶液（4.7),再向A管中加3mL氧化剂碱性铁氰化钾溶液（4.9），轻轻旋摇。依次立即向A管加入15mL正丁醇加塞，剧烈地振摇15s，再向B管加入15mL正丁醇加塞。共同振摇90s，静置分层。
7.4.3用注射器吸去下层水相，向各反应管加入约2g无水硫酸钠（4.15），旋摇，待测。7.4.4同时将5mL作为外标的洗脱液（7.3.4），置入另两只反应管，相应地记作C、D，按7.4.1~7.4.3操作。
7.5测定
7.5.1用硫酸奎宁工作液（4.13.2)调整荧光仪，使其稳定于一定数值，作为仪器工作的固定条件。7.5.2于激发波长365nm，发射波长435nm处测定各反应管中萃取液［（7.4.3)和（7.4.4)的荧光强度。
8分析结果的计算和表述
8.1计算公式
硫胺素（维生素B,）含量以mg/kg（或g/kg）表示，按下式计算：T-To×c××m
硫胺素(VB,mg/kg）=
式中：T——A管试液的荧光强度；TB管试液空白的荧光强度；
S C管标准溶液的荧光强度;
S.——D管标准溶液空白的荧光强度；C-硫胺素标准工作液浓度，μg /mL；V。-提取液总体积，mL；
V.-分取提取液过柱的体积，mL;V.--酸性氟化钾洗脱液体积，mL；川—--试样质量·g。
GB/T14700—93
8.2平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数3位。复性
同一分析者对同试样同时或快速连续进行两次测定，所得结果之间的差值：在硫胺素含量小于或等于5.0mg/kg时，不得超过平均值的15%。在硫胺素含量大于5.0mg/kg时，不得超过平均值的10%。在硫胺素含量大于50mg/kg时不得超过平均值的5%。附加说明：
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出。本标准由国家饲料质检中心（北京)负责起草。本标准主要起草人陈必芳、俞巧玲、李兰、曹建民。本标准参照采用AOAC1990年版（942·23）测定方法。2013
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