【国家标准(GB)】 饲料中维生素B2测定方法

中华人民共和国国家标准
饲料中维生素B2测定方法
Method for the determination of Vitamin B2 in feeds1主题内容与适用范围
本标准规定了饲料中维生素B2测定方法。GB/T 14701--93
本标准适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、维生素预混料中维生素B2的测定。待测液中维生素Bz检测浓度为0.05~0.2 μg/mL。2引用标准
GB6682实验室用水规格
3方法原理
维生素Bz（即核黄素C1,H2oN,O)在440nm紫外光激发下产生绿色荧光，在一定浓度范围内其荧光强度与核黄素浓度成正比。用连二亚硫酸钠还原核黄素成无荧光物质，由还原前后荧光强度之差与内标荧光强度的比值，计算样品核黄素的含量。4试剂和溶液
除特殊规定外，本标准所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或相应纯度的水。4.1盐酸溶液，0.1mol/L：将8.5mL盐酸(GB622)用水稀释至1000mL。4.2盐酸溶液，1 mol/L。
4.3氢氧化钠(GB629)溶液，1mol/L。4.4冰乙酸(GB676)。
4.5冰乙酸溶液，0.02mol/L：将1.8mL冰乙酸用水稀释至1000mL。4.6高锰酸钾（GB643)溶液，40g/L。4.7过氧化氢（HG3--1082)溶液，100mL/L。现用现配。4.8核酸素标准溶液
4.8.1核黄素贮备液I：核黄素（中国药典参照标准），于五氧化二磷干燥器中干燥24h，称取0.0500g，溶解于0.02mol/L.乙酸溶液（4.5)中，在蒸汽浴上恒速搅动直至溶解，冷却后稀释至500mL。盛入棕色瓶滴加甲苯覆盖，低温（4℃C）保存。该溶液每毫升含0.1mg核黄素。
4.8.2核黄素贮备液耳：取核黄素贮备液（4.8.1)10mL用0.02mol/L乙酸溶液稀释至100mL，盛于棕色瓶中滴加甲苯覆盖，低温（4℃)保存。该溶液每毫升中含10ug核黄素。4.8.3核黄素标准工作液：取核黄素贮备液I（4.8.2)10mL，用水稀释至100mL。现用现配。该溶液每升中含1μg核黄素。
国家技术监督局1993~11-06批准201
1994-06-01实施
4.9荧光素标准溶液
GB/T 14701--93
4.9.1荧光素贮备液：称取荧光素（Q/HG22—786)0.0500g，用水稀释至1000mL，盛于棕色瓶中，低温（4C)保存。
该溶液每毫升中含50μg荧光素。4.9.2荧光素标准工作液：取荧光素贮备液（4.9.1)1mL，用水定容至1000mL，盛入棕色瓶中，低温保存。
该溶液每毫升中含0.05μg荧光素。4.10溴钾酚绿pH指示剂：取溴钾酚绿（HGB3386)0.1g，加氢氧化钠溶液（0.05mol/L)2.8mL使之溶解，再加水稀释至200mL。变色范围pH3.6~5.2。4.11连二亚硫酸钠（NazS2O.)(Q/HG2—001),防止吸潮。5仪器、设备
5.1荧光分光光度计。
5.2分析天平：感量0.0001g。
5.3电热恒温水浴。
5.4具塞玻璃刻度试管，15mL。
6试样的制备
采集具有代表性的样品至少500g，四分法缩减至100g，磨碎，通过0.28mm孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。
7分析步骤
7.1称样：单-饲料、配合饲料、浓缩饲料称取1～2g，精确至0.001g。维生素预混料称取0.25~0.50g，精确至0.0001g，将试样置于100mL容量瓶中。7.2样液的制备：向盛样品的容量瓶中加65mL盐酸溶液（4.1），于沸水浴中加热30min，开始加热5～10min时常摇动容量瓶，以防样品结块。或于121~~123℃15磅高压釜中加热30min。冷却至室温后，用氢氧化钠溶液（4.3）调节pH至6.0~6.5，然后立即加稀盐酸溶液（4.2)使pH值约为4.5（溴甲酚绿指示剂变为草绿色）。用水稀释至刻度。通过中速无灰滤纸过滤，弃去最初5～10mL溶液，收集滤液于100mL锥形瓶中。取整份清液，滴加稀盐酸检查蛋白质如有沉淀生成，继续加氢氧化钠溶液，剧烈振摇，使之沉淀完全稀释到测量体积。对高含量样品，取整分的澄清液，用水稀释至一定体积使含核黄素约为0.1μg/mL（以下操作避免紫外光照射)。
7.3杂质氧化：于a、b、c三支15mL刻度试管（5.4)中各吸入样液（7.2)10mL，同时做平行，向试管a、c中各加入1mL蒸馏水，向试管b中加入1mL核黄素工作液（4.8.3）。然后各加入冰乙酸（4.4)1ml，旋摇混匀后逐个加高锰酸钾溶液（4.6)0.5mL，旋摇混匀，静置2min，再逐个加入过氧化氢溶液（4.7）0.5mL旋摇，使高锰酸钾颜色在10s内消退。加盖摇动，使试管中的气体逸尽。7.4测定：用荧光素溶液（4.9.2)调整荧光仪，使其稳定于一定数值，作为仪器工作的固定条件。调整激发波长440nm，发射波长525nm，测定试管a、b的荧光强度，样液在仪器中受激发光照射不超过10s。在试管c中加入20mg连二亚硫酸钠，摇动溶解，并使试管中的气体逸出，迅速测定其荧光强度作为空白。若溶液出现浑浊，不能读数。．8分析结果的计算和表述
8.1计算方法和公式
GB/T 14701—93bZxz.net
核黄素（维生素B,)含量以mg/kg（或g/kg）表示，按下式计算：A-CMV
核黄素（VBzmg/kg）-
B-A×m×V
式中：A-—试管a(样液加水)的荧光强度；B-----试管b（样液加标样)的荧光强度；C-试管c(样液加连二亚硫酸钠)的荧光强度；M-加入核黄素标样的量，μg；
V--样液的初始体积，mL
V,----测定时分取样液的体积,mL；m-
-试样质量，g。
R-——稀释倍数。
多二%值应在0.66~1.5.否则需调整样液的浓度。A
8.2平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数3位。9 重复性
同一分析者对同一试样同时或快速连续进行两次测定，所得结果之间的差值：在核黄素含量小于或等于5.0mg/kg时，不得超过平均值的15%。在核黄素含量大于5.0mg/kg时，不得超过平均值的10%。在核黄素含量大于50mg/kg时不得超过平均值的5%。附加说明：
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出。本标准由国家饲料质检中心(北京)负责起草。本标准主要起草人陈必芳、李兰、俞巧玲、曹建民。本标准参照采用AOAO1990年版（970.65）测定方法。206
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