【国家标准(GB)】 医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分：生物学实验方法

ICS11:040.20
中华人民共和国国家标准
GB/T14233.2--2005
代替GB/T14233.2-1993
医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法
Test methods for infusion,transfusion,injection equipment for medical use-Part2:Biologicaltestmethods
2005-11-17发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2006-05-01实施
GB/T14233.2—2005
规范性引用文件
无菌试验
细菌内毒素试验
热原试验
急性全身毒性试验
溶血试验
细胞毒性试验
致敏试验(最大剂量法）
皮内反应试验
植入试验
附录A（资料性附录）
亚急性(亚慢性)全身毒性试验
主要设备和器具
试验前准备
试验方法
A.6试验报告
附录B（资料性附录）
与血液(器械)相互作用试验
体内静脉血栓形成试验
全血凝固时间试验
部分凝血激活酶时间(PTT)试验
体外自发性血小板聚集试验
血小板粘附试验
补体激活试验
附录C（资料性附录）
细胞培养常用溶液和培养液制备平衡盐溶液(BSS)…
消化液
四唑盐（MTT)染色液
RPMI1640细胞培养液
GB/T14233《医用输液、输血、注射器具检验方法》分为两部分：第1部分：化学分析方法；
第2部分：生物学试验方法。
GB/T14233.2—2005
本部分为GB/T14233的第2部分。本部分代替GB/T14233.2一1993&医用输液、输血、注射器具检验方法第二部分：生物试验方法》。本次修订对无菌、热原、细菌内毒素三项试验直接引用《中国药典（二部）》中的适用章节，以能与中国药典的最新修订版保持同步；参照GB/T16886《医疗器械生物学评价》修改了细胞毒性试验方法；致敏、皮内反应和植入试验直接引用GB/T16886《医疗器械生物学评价》；增加了亚急性(亚慢性)全身毒性和血液(器械)相互作用试验方法；取消了产品合格判定指标。本部分的附录A、附录B和附录C均为资料性附录。本部分由国家食品药品监督管理局提出。本部分由全国医用输液器具标准化技术委员会归口。本部分起草单位：国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心、天津医用生物材料监测研究中心。
本部分主要起草人：由少华、朱雪涛、刘欣、黄经春、王昕、祝君梅、王科镭、郝树彬。本部分于1993年3月首次发布。
GB/T14233.2—2005
本部分给出的生物学试验方法是根据GB/T16886.1《医疗器械生物学评价第1部分：评价与试
验》的基本原则，特别针对医用输液、输血、注射器具的生物学评价需求所设立的。本次修订是在GB/T16886《医疗器械生物学评价》和《中国药典（二部）》中相应试验方法学原理和试验步骤的基础上，并根据医用输液、输血、注射器具的特性制定而成，因此本部分是与GB/T16886和《中国药典》方法具有方法学等同性，适用于医用输液、输血、注射器具生物学性能检验的方法标准。本次修订对无菌、热原、细菌内毒素试验直接引用《中国药典》中的适用章节，并不注明药典的年代号，以能够与《中国药典》的最新修订版保持同步；对GB/T16886中未给出详细试验步骤的试验项目进行了细化，例如细胞毒性、急性全身毒性、亚急性（亚慢性)全身毒性和与血液（器械)相互作用试验；对GB/T16886中已详细给出试验步骤的刺激、致敏和植人试验，本次修订采用直接引用GB/T16886相应部分。
本部分作为试验方法标准，本次修订在正文中取消了产品合格判定指标，但在条注中给出了当前通用的判定指标供参考。相关产品标准在引用本部分时应注意根据产品应用特性规定适宜的合格判定指标。
1范围
医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法
GB/T14233的本部分规定了医用输液、输血、注射器具生物学试验方法。本部分适用于医用输液、输血、注射器具。2规范性引用文件
GB/T14233.2--2005
下列文件中的条款通过GB/T14233的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T16886.1
10993-1:1997)
医疗器械生物学评价
GB/T16886.4
医疗器械生物学评价
2003,ISO10993-4:2000,IDT)
医疗器械生物学评价
GB/T16886.5
10993-5:1999,IDT)
GB/T16886.6
医疗器械生物学评价
idtISO10993-6:1996)
GB/T16886.10
医疗器械生物学评价
2005,ISO10993-10:2002,IDT)
GB/T16886.11
ISO 10993-11:1993)
GB/T16886.12
第1部分：评价与试验（GB/T16886.1一2001，idtISO第4部分：与血液相互作用试验选择（GB/T16886.4一第5部分：体外细胞毒性试验（GB/T16886.5一2003，ISO第6部分：植人后局部反应试验（GB/T16886.6一1997，第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验（GB/T16886.10-医疗器械生物学评价
医疗器械生物学评价
2005,ISO10993-12:2002,IDT)
中华人民共和国药典二部
无菌试验
3.1目的
第11部分：全身毒性试验（GB/T16886.11--1997，idt第12部分：样品制备与参照样品（GB/T16886.12-本试验系将医疗器械或其浸提液接种于培养基内，以检验供试品是否有细菌和真菌污染。2试剂
质量浓度为9g/L的无菌氯化钠溶液、其他符合《中国药典》要求的稀释液和冲洗液。3.3
3主要设备
超净工作台、光学显微镜、恒温培养箱、恒温水浴箱、压力蒸汽灭菌器、电热干燥箱。3.4试验前准备
器具灭菌
与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内121℃30min，或置电热干燥箱内160℃2h。
GB/T14233.2—2005
3.4.2无菌室要求
3.4.2.1无菌室操作台或超净工作台局部应符合洁净度100级单向流空气区域要求。无菌室在消毒处理完毕后，应检查空气中的菌落数，方法如下：取直径约90mm培养血，无菌操作注入融化的营养琼脂培养基约20mL，在30℃～35℃培养48h证明无菌后，取3只培养血在无菌室操作台或超净工作台平均位置打开上盖，暴露30min后盖好置30℃～35℃培养48h后取出检查。3只培养皿上生长的菌落数平均应不超过1个。
3.4.2.2无菌试验过程中应检查空气中的菌落数，方法同上。在试验开始进行时打开培养血盖，至试验结束后盖好照上法培养，应符合上述要求。3.5培养基
用于培养需（厌)气菌和真菌的培养基的制备、培养基灵敏度检查及其他各项要求应符合《中国药典（二部）》附录中《无菌检查法》的规定。3.6供试品抑菌性验证试验
对未知或可疑的供试品，在进行无菌试验前，应按照《中国药典（二部）》附录中“无菌检查法”的规定进行方法验证试验，以确认供试品在该试验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计。3.7试验方法
3.7.1供试品数量
同一批号3个～11个单位供试品。注：其他类型医疗器械可根据具体情况参照采用。3.7.2漫提介质
质量浓度为9g/L的无菌氯化钠溶液或其他符合《中国药典》要求的稀释液和冲洗液。3.7.3供试液制备
优先采用将供试品或其有代表性的各部分直接投放入培养基内培养。如供试品不适宜直接投放，可按下列方法制备供试液，应使浸提介质充分洗提供试品的浸提表面。供试液制备应按无菌操作法进行，在制备后2h内使用。
根据供试品具体特性选择下列适用方法：管类器具：按管内表面积每10cm2流过管内腔1mL浸提介质，流量约为10mL/min。a）
容器类器具：容器内已装有液体的可直接抽取容器内液体为供试液：空容器按容器内表面积每10cm2加入漫提介质1mL，振摇数次，c）实体类器具：实体类器具按表面积每10cm2加人浸提介质1mL，振摇数次。3.7.4接种、培养和观察
根据供试品具体特性选择《中国药典（二部》》附录中“无菌检查法”规定的适宜接种方式，以无菌操作法进行。
供试品的培养和观察按《中国药典（二部）》附录中“无菌检查法”的规定。3.7.5结果判定
按《中国药典（二部）》附录中“无菌检查法”的规定。3.7.6试验报告
试验报告中宜给出下列信息：
供试品名称；
生产批号和(或)灭菌批号；
供试液制备方法；
接种方式；
每日观察结果；
结果判定。
4细菌内毒素试验
4.1目的
GB/T14233.2—2005
本试验为《中国药典（二部）》附录“细菌内毒素检查法”中规定的“凝胶法”，系利用鲨试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判定供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。如经检验证实供试品对细菌内毒素试验有不能排除的干扰作用则不适宜采用本试验。4.2试剂
细菌内毒素国家标准品、细菌内毒素工作标准品、鲨试剂、细菌内毒素检查用水。注：细菌内毒素检查用水系指符合《中国药典（二部）》附录中“细菌内毒素检查法”规定的灭菌注射用水。4.3主要设备
超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、电热干燥箱、旋涡混合器。4.4试验前准备
4.4.1器具处理
试验所用器皿需经处理除去可能存在的外源性内毒素。玻璃器皿置电热干燥箱内180℃于烤至少2h，或250℃干烤至少30min。塑料器皿置30%双氧水中浸泡4h，再用细菌内毒素检查用水充分冲洗后置60℃烘干备用。
4.4.2鲨试剂灵敏度复核试验
4.4.2.1当使用新批号的鲨试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲨试剂灵敏度复核试验
4.4.2.2试验步骤按《中国药典（二部）》附录中细菌内毒素检查法”规定进行。4.4.3
供试品干扰试验
对未知或可疑的供试品初次进行细菌内毒素试验之前应先进行干扰试验，以检验供试品对细4.4.3.1
菌内毒素试验是否有抑制或增强作用，以及其他影响细菌内毒素试验准确性和敏感性的干扰作用。当鲨试剂、供试品来源、供试品配方或生产工艺有变化或其他任何可能影响细菌内毒素试验结果的试验条件改变时，应重新进行干扰试验。每种医疗器械产品应取3批并分别使用不少于两个制造商生产的鲨试剂进行干扰试验。供4.4.3.2
试液制备按4.5.3规定进行。
4.4.3.3试验步骤按《中国药典（二部）》附录“细菌内毒素检查法”中“凝胶法”规定进行供试品如对细菌内毒素试验有干扰作用，可选用下列适宜方法排除于扰：4.4.3.4
使用更灵敏的鲨试剂对供试液进行更大倍数稀释；a)
采用无热原氨基甲烷缓冲液稀释供试液；b）
采用无热原氢氧化钠或盐酸溶液调节供试液pH值在6.0~8.0范围内；c）
d）采用阳离子缓冲液（MgSO，或MgClz）稀释供试液以调节离子浓度。4.5试验方法
4.5.1供试品数量
同一批号至少3个单位供试品。
4.5.2浸提介质bzxz.net
细菌内毒素检查用水。
4.5.3供试液制备
根据产品标准规定的细菌内毒素限值确定浸提介质体积，选用下列适宜方法制备供试液：管类和容器类器具用细菌内毒素检查用水浸泡器具内腔，在（37土1)℃恒温箱中浸提不少于a）
b）小型配件或实体类器具置无热原玻璃器血内，加入细菌内毒素检查用水振摇数次，在3
GB/T14233.2—2005
(37±1)℃恒温箱中浸泡不少于1h。供试液贮存应不超过2h。
注1；浸提介质体积计算公式：V=L/入式中：
浸提介质体积，单位为毫升（mL）；L—产品细菌内毒素限值，单位为细菌内毒素单位每件(EU/件)；入——所用鲨试剂灵敏度标示值，单位为细菌内毒素单位每旁升(EU/mL)。注2：输液、输血、注射器具细菌内毒素限值在产品标准中规定，宜尽可能低。推荐输液、输血、注射器具细菌内毒素限量每件不超过20EU，与脑脊液接触和胸内应用医疗器械每件不超过2.15EU.试验步骤和结果判定
按《中国药典（二部）》附录“细菌内毒素检查法”中“凝胶法”规定进行。4.5.5试验报告
试验报告中宜给出下列信息：
供试品名称；
生产批号；
供试液制备方法；
细菌内毒素限量；
结果判定。
热原试验
本试验系将医疗器械浸提液注人家免静脉，在规定的时间内观察家兔体温升高的情况，以判定供试品是否具有潜在的材料致热作用。5.2试剂
质量浓度为9g/L的无菌无热原氯化钠注射液。主要设备
超净工作台、电热干燥箱、电热恒温水浴箱、压力蒸汽灭菌器、热原测试仪。5.4试验前准备
5.4.1器具除热原
与供试液接触的所有玻璃器皿置电热干煤燥箱内180℃干烤至少2h，或250℃干烤至少30min。也可采用其他适宜的方法除热原。5.4.2测温器具
家免体温测试应使用精密度为士0.1℃的热原测温仪或肛门体温计。5.4.3实验室环境
在试验前1d～2d，供试用家兔应处于同一温度环境中，实验室和饲养室的温度相差不得大于5℃，实验室温度应为17℃～28℃。在试验全过程中，室温变化不大于3℃，避免噪音干扰。5.4.4试验用家免
按《中国药典（二部）》附录“热原检查法”中规定挑选试验用兔。每一家免的使用次数应不超过10次。
5.5试验方法
5.5.1供试液制备
按GB/T16886.12规定选择适宜的浸提条件。4
5.5.2试验步骤
GB/T14233.2—2005
按《中国药典（二部）》附录“热原检查法”中规定进行，家兔注射剂量为10mL/kg。5.5.3结果判定
供试品经初试或复试后符合《中国药典（二部）》附录“热原检查法”中规定时，均判定无材料致热作用。
5.6试验报告
试验报告中宜给出下列信息：
a）供试品名称；
b）生产批号；
供试液制备方法；
d）注射剂量；
e）家兔体温记录；
结果判定。
6’急性全身毒性试验
6.1目的
本试验系将医疗器械浸提液注入小白鼠静脉和腹腔内，在规定时间内观察小白鼠有无毒性反应和死亡情况，以判定供试品是否具有潜在的急性全身毒性作用。试剂
质量浓度为9g/L的氯化钠注射液、新鲜精制植物油。注：本部分各试验中所用新鲜精制植物油推荐采用符合《美国药典》24版规定的棉籽油或芝麻油，也可使用其他经验证证实无生物学毒性反应的植物油。6.3主要设备和器具
压力蒸汽灭菌器、动物天平、皮下注射器。6.4试验前准备
6.4.1器具灭菌
与供试液接触的所有器具置压力蒸汽灭菌器内121℃30min。6.4.2试验动物准备
6.4.2.1试验采用健康、初成年小白鼠，同一品系并同一来源，雌鼠无孕，体质量17g～23g。在试验前使小白鼠适应实验室环境。做过本试验的小白鼠不得重复使用。6.4.2.2每种浸提液用小白鼠10只，随机分为供试品和浸提介质对照两组，每组5只。复试时每组取18g～19g的小白鼠10只。
6.5试验方法
6.5.1供试液制备
按GB/T16886.12规定选择适宜的浸提条件，每种供试品制备质量浓度为9g/L的氯化钠注射液和植物油两种浸提液。同条件制备浸提介质对照液。6.5.2供试液注射
6.5.2.1自尾静脉分别注人氯化钠注射液浸提液和介质对照液，以不超过0.1mL/s的恒定速度注射，注射剂量为50mL/kg。
6.5.2.2由腹腔分别注入植物油浸提液和介质对照液，注射剂量为50mL/kg。6.5.3注射后动物反应观察
注射完毕后，观察小白鼠即时反应，并于4h、24h、48h和72h观察和记录试验组和对照组动物的一般状态、毒性表现和死亡动物数，在72h时称量动物体质量。动物反应观察判定按表1规定。5
GB/T14233.2—2005
反应程度
正常，无症状
结果判定
反应。
反应。
毒性反应观察
注射后无毒性症状。
注射后有轻微症状但无运动减少、呼吸困难或腹部刺激症。注射后出现明显的腹部刺激症状、呼吸困难、运动减少、眼验下垂或腹泻（体质量下降至15g～17g之间)。
注射后出现虚脱、发、震颜或严重腹部刺激症状、腹泻、眼脸下垂或呼吸困难（体质量急剧下降，一般低于15g)。注射后死亡。
在72h观察期内，试验组动物的反应不大于对照组动物，则判定供试品无急性全身毒性如试验组动物有2只或2只以上出现中度毒性症状或死亡，则判定供试品有急性全身毒性如试验组动物出现轻微毒性症状，或不超过1只动物出现中度毒性症状或死亡，或虽无毒性症状但组内动物体质量普遍下降，则另取小白鼠10只为1组进行复试，复试结果符合6.5.4.1要求，判定供试品无急性全身毒性反应。6.6试验报告
试验报告中宜给出下列信息：
供试品名称；
生产批号；
供试液制备方法；
注射剂量；
动物反应情况：
结果判定。
溶血试验
本试验系将医疗器械与血液直接接触，通过测定红细胞释放的血红蛋白量以判定供试品的体外溶血程度。本试验不适用于评价带药剂的器械。7.2试剂
草酸钾、质量浓度为9g/L的氯化钠注射液、新鲜抗凝兔血。注：采集时间不超过24 h的新鲜构酸钠抗凝人体全血如经验证确认适用时可替代免血用于本试验。7.3主要设备
电热恒温水浴、分光光度计、离心机。供试品制备
7.4.1由器械各组成部件称取15g。管类器具切成约0.5cm长小段；其他类型器具切成约0.5cmX2cm条状或相应大小块状。
7.4.2器械如为低密度材料或其他不适宜采用7.4.1规定的样品质量的情况下，可按GB/T16886.12规定的浸提比例制备供试品，切成7.4.1规定的尺寸。7.5新鲜稀释抗凝兔血制备
根据试验用血量由健康家免心脏采血。如采血10mL，加质量浓度20g/L草酸钾溶液0.5mL，制6
GB/T14233.2-2005
备成新鲜抗凝兔血。取新鲜抗凝免血8mL，加质量浓度9g/L的氯化钠注射液10mL稀释。7.6试验方法
供试品组每管加入供试品5g，或是在7.4.2的情况下按GB/T16886.12规定的浸提比例加人供试品，再加人氯化钠注射液10mL；阴性对照组每管加人氯化钠注射液10mL；阳性对照组每管加入蒸馏水10mL。每组平行操作3管。
全部试管放人恒温水浴中（37士1)℃保温30min后，每支试管加人0.2mL稀释兔血，轻轻混匀，置（37土1)℃水浴中继续保温60min。倒出管内液体以800g离心5min。吸取上清液移人比色血内，用分光光度计在545nm波长处测定吸光度。7.7
结果计算
供试品组和对照组吸光度均取3管的平均值。阴性对照管的吸光度应不大于0.03，阳性对照管的吸光度应为0.8士0.3，否则应重新试验。供试品溶血率按式(1)计算：
溶血率：
式中：
A—--供试品组吸光度；
B-阴性对照组吸光度；
C—--阳性对照组吸光度。
7.8结果判定
×100%
根据医疗器械预期临床用途和器械材料特性确定适宜的合格判定指标。注：按本试验检验医疗器械时，合格判定指标一般规定为落血率应小于5%。7.9试验报告
试验报告中宜给出下列信息：
供试品名称；
生产批号；
试验方法：
各组吸光度；
供试品溶血率；
结果分析和判定。
细胞毒性试验
（1）
本试验系将医疗器械浸提液接触培养细胞，通过对细胞形态、增殖和抑制影响的观察，评价供试品对体外细胞的毒性作用。
8.2试剂
氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠、葡萄糖、酚红、台盼蓝、乙二胺四乙酸二钠（EDTA)、胰蛋白酶、Eagie培养基、RPMI1640培养基、胎（小)牛血清、青霉素G(钠盐）、硫酸链霉素、乙醇、苯酚、二甲基亚矾(DMSO)。主要设备和用具
超净工作台、二氧化碳(CO,)培养箱、恒温水浴箱、电冰箱、倒置显微镜、光学显微镜、压力蒸汽灭菌器、抽滤瓶、磁力搅拌器、培养板（皿)。8.4试验前准备
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